[发明专利]一种结核分枝杆菌菌体发酵的方法

说明书

技术领域

本发明涉及结核分枝杆菌的发酵方法，属于生物发酵领域。

背景技术

结核病是由结核分枝杆菌复合群感染引起的多器官感染性疾病，主要为肺结核。其中我国每年新发患者高达150万。结核杆菌流行病学的一个重要特征是结核分枝杆菌的潜伏感染。结核分枝杆菌潜伏性感染是一种亚临床状态，无放射检查征象，细菌呈休眠状态，约有10％的结核分枝杆菌潜伏性感染人群一生中会发展成为结核病患者。

目前结核杆菌潜伏感染人群尚无诊断金标准，PPD皮试试验是诊断结核杆菌潜伏感染人群的常用方法，但这一方法有一定的缺陷性，因为试验所用PPD抗原为结核分枝杆菌、非致病性分枝杆菌和卡介苗(即BCG)所共有，具有交叉反应，诊断特异性差。我国是普遍接种卡介苗的国家，而由于卡介苗接种者和结核杆菌自然感染者对PPD试验的反应在表现上很难区分，即使采用上述的PPD皮试试验强阳性作为判断标准，仍然会有一部分卡介苗接种者以及非致病性分枝杆菌的感染者被纳入结核杆菌潜伏感染人群中，因此导致PPD试验在结核杆菌潜伏感染人群诊断中的实际作用十分有限。需寻找一种新的特异性高、副作用小的制剂代替。重组结核分支杆菌蛋白38K D a(r T P A38)是结核分支杆菌的一种脂蛋白和主要抗原，其诱发豚鼠迟发型超敏反应D T H的效果优于其它单一抗原。用于结核病血清学检测的敏感性和特异性较高。因此，r T P A38蛋白是目前具有较好应用前景的蛋白。

但是，在现有技术中，由于结核分枝杆菌在细胞的培养过程中，并不像大肠杆菌那样能够大量的表达目的蛋白，而用大肠杆菌预案和表达r T P A38蛋白又存在这折叠活性低的缺陷，因此，本发明人基于现有技术的缺陷，设计了本发明。本发明通过逐步优化现有技术中的结核分枝杆菌培养方法，提供了一种全新的结核分枝杆菌发酵方法，通过菌株的一级扩增、二级扩增、一级发酵、二级发酵最终实现了结核分枝杆菌菌浓超高、目的蛋白大量表达的结果。

发明内容

本发明的目的在于提供：结核分枝杆菌菌体发酵的方法，从而收集扩增得到的大量菌体，获得大量的目的蛋白，促进了r T P A38蛋白用于大规模疫苗的使用。

本发明的技术方案：结核分枝杆菌菌体发酵的方法，包括如下步骤：一、一级扩增液制备：取斜面单菌落，置于一级扩增培养基的试管中，于全温振荡培养箱中培养过夜；在超净工作台中向每瓶一级扩增培养基中加入氨苄青霉素，然后接种试管中的菌种，于全温振荡培养箱中恒温振荡培养，每瓶取样检测OD600值为大约1-2即可；

二、二级扩增液：取一级种子液接种到二级扩增培养基中，于全温振荡培养箱中恒温振荡培养，每瓶取样检测OD600值为1-2即可；

三、一级发酵培养：接种前设定通气为2500L/h，罐压为0.04Mp，搅拌速度为560rpm，温度为37℃时的溶解氧为100%。以5%-7%的接种量接种二级扩增液到种子罐内的10L发酵培养基中，发酵培养，培养2-4h至OD₆₀₀2～3，培养过程中每隔半小时测定发酵液的OD600值；

四、二级发酵培养：将种子罐内OD600符合要求的一级发酵菌液以5-10%的接种量接种到发酵罐内120L发酵培养基中；连续通气培养约4至5小时后OD600≥8收菌，培养过程中每隔约半小时测定发酵液的OD600值；

五、收菌：采用管式高速离心机进行离心菌液弃上清液，将菌体收集存放于洁净容器中。

六、质量指标：涂片革兰氏染色，在光学显微镜下观察应呈典型的革兰氏阴性杆菌，菌体总蛋白中（目的蛋白rTPA38）不低于15%，发酵收率：不低于12g/L，计算公式：发酵收率(g/L)＝湿菌重量(g)/发酵基础培养基量（L）。

本发明的有益效果：本发明人通过改进了结核分枝杆菌的发酵方法，优化了每一步的具体的条件参数，获得全新的结核分枝杆菌的发酵方法，发酵收率不低于12g/L，而且菌体中总的rTPA38目的蛋白可达15%以上，活性也较高，这些都是现有技术无法达到的。菌体发酵的批量大，一次性可发酵10L至200L，收菌速度快，生产效率高。

附图说明

图1发酵菌液革兰氏染色光学显微镜（典型的革兰氏阴性杆菌）

图2菌体发酵方法工艺流程图

具体实施方式

实施例1：

培养基配制

（1）结核分枝杆菌扩增培养基为罗氏鸡蛋斜面培养基，购买自罗氏公司。