[发明专利]一种结核分枝杆菌菌体发酵的方法

权利要求书

1.结核分枝杆菌菌体发酵的方法，包括以下步骤：

一、一级扩增液制备：取结核分枝杆菌斜面单菌落，置于含有3mL扩增培养基的试管中，于全温振荡培养箱中恒温37±1℃、转速170r/min振荡培养过夜；在超净工作台中向含有8mL扩增培养基的三角瓶中加入50mg/mL氨苄青霉素8μl，然后接种80μl试管中的菌种，于全温振荡培养箱中恒温37±1℃、转速170r/min振荡培养10-12h后，取样，至OD600值约为1即可停止培养；

二、二级扩增液：接种前，在超净工作台中向2瓶含有500mL扩增培养基的三角瓶中加入50mg/mL氨苄青霉素500μl，然后取一级扩增液5mL接种到二级扩增培养基中，于全温振荡培养箱中恒温37±1℃、转速170r/min振荡培养12-14h后，取样，至OD600值约为1.5即可；

三、一级发酵培养：接种前设定通气为2500L/h，罐压为0.04Mp，搅拌速度为560rpm，温度为37℃时的溶解氧为100%；（2）接种前工作：连接500mL浓度为28%浓氨溶液补料瓶以及500mL浓度10%稀盐酸溶液补料瓶，调节培养基的pH至6.8-7.0；（3）接种：以5%-7%的接种量接种到种子罐内的10L发酵培养基中；（4）发酵培养：培养温度37±1℃，初始搅拌速度为100rpm,通气量为300L/h,罐压0.02-0.04Mpa，pH6.8-7.0,培养过程中自动补加浓氨溶液以及稀盐酸调节pH，溶氧设定35%，控制在30%-40%之间，溶氧与转速偶联，若溶氧低于30%，加大通气量，培养2-4h至OD₆₀₀2～3，培养过程中每隔半小时测定发酵液的OD600值；

四、二级发酵培养：（1）接种前设定通气为16m³/h，罐压为0.04Mp，搅拌速度为400rpm，温度为37±1℃时的溶解氧为100%；(2)接种前工作：连接500mL浓度为28%浓氨溶液补料瓶、500mL浓度10%稀HCl溶液补料瓶、4L80%碳源补料瓶；（3）接种：将一级发酵后的OD600符合要求的种子液以5-10%的接种量接种到发酵罐内120L发酵培养基中；(4)发酵培养：初始搅拌速度为100rpm,通气量为1.8m³/h,pH6.8-7.0,37±1℃培养，溶解氧下降至35%后，设定DO为35%与转速关联控制，控制在30%-40%，若关联控制溶氧仍低于30%，取消关联，可调转速及逐渐调大通气量，最大可调至16m³/h，培养过程中自动补加浓氨溶液以及稀盐酸溶液以调节pH，溶解氧设定值为15%，当OD600≥3时,，调节转速控制溶氧在10%-20%，通气量仍保持诱导前的通气量，当DO显著上升时,以碳源限制模式流加入灭菌的80%碳源。37±1℃继续连续通气培养4至5小时后OD600≥8收菌，培养过程中每隔约半小时测定发酵液的OD600值；

收菌：采用管式高速离心机以45Hz频率、14000rpm进行离心菌液弃上清液，流速为1.4-1.8L/min，将菌体收集存放于洁净容器中，记得到发酵好的目的菌体；

五、培养基配制如下：

（1）结核分枝杆菌扩增培养基为罗氏鸡蛋斜面培养基，购买自罗氏公司。

（2）发酵培养基（1000mL）：硒酸钠10mg，磷酸二氢钾2.4g，b)硫酸镁0.24g，c)枸橼酸0.6g，d)天门冬素3.6g，e)甘油20mL，f)马铃薯淀粉40g，g)新鲜鸡卵液930mL，h）谷氨酸钠0.15g余量为水。

（3）其它补料液的配制：

稀盐酸溶液分装（1000mL）：取稀盐酸HCl1000mL各分装500mL入2个500mL已灭菌补料瓶中，浓氨溶液分装（1000mL）：取浓氨溶液1000mL各分装500mL入2个500mL已灭菌补料瓶中；

80%碳源配制（8L）：称取甘油6400g溶于纯化水中至总体积为8L，分装入5L补料瓶中，每瓶4L，121℃灭菌20min，冷却后常温密闭存放。

50mg/mL氨苄青霉素（10mL）：称取1g氨苄青霉素用20mL纯化水溶解。在超净工作台中，用无菌针头过滤器过滤除菌，分装入已灭菌容器中，分装规格为1mL/1.5ml EP管，共10管，2-8℃冰箱中保存待用。