[发明专利]一种检测食品中大肠杆菌胞内β-葡萄糖苷酸酶的双抗体夹心法

说明书

技术领域

本发明涉及了一种基于单克隆抗体的检测食品中大肠杆菌胞内β-葡萄糖苷酸酶的双抗体夹心法，属于免疫分析技术领域。

背景技术

大肠杆菌(Escherichia coli，E.coli），1885年由Escherich发现，分布在自然界，主要附生在人或动物的肠道里，为正常菌群，少数的大肠杆菌具有毒性，可引起疾病。

E.coli常随粪便散布在环境中，作为温血动物肠道细菌的代表，大肠杆菌常作为饮水和食物（或药物）的卫生学标准。若在水和食品中检出此菌，可认为是被粪便污染的指标，从而可能有肠道病原菌的存在。大肠杆菌β-葡萄糖苷酸酶是位于大肠杆菌胞质空间和表面的一种分子量为 68KDa的酶。因此，β-葡萄糖苷酸酶是Elisa检测大肠埃希氏菌E.coli的理想检测对象。

目前，检测E.coli的方法有培养法、酶底物法、PCR方法等。培养法是检测E.coli的国标方法，尽管权威可靠，但一般需要10天得到结果，且操作过程繁琐，不能适应快速检测的要求；酶底物法多利用E.coli属特异性的β-碱性磷酸酯酶或者β-D-葡萄糖苷酸酶的酶学活性催化底物产生荧光，从而在24h内实现对E.coli的检测，优点是检测时间短，操作简单，缺点是酶活性质易受温度、pH、离子强度的影响，国外产品质量较为稳定，但相对比较昂贵；PCR方法，检测E.coli属特异性的DNA片段，具有灵敏度高、检测时间短的特点，缺点是成本较高、需要较高的操作技术，且不能避免增菌过程。

  尽管食源性致病菌检测方法不断发展，Elisa凭借其快速、灵敏、特异性好、高通量、不需要大型仪器，易于推广的特点成为目前检测微生物的常用方法。直接检测微生物的Elisa试剂盒检测抗原通常为菌体的表面抗原，检测抗体一般有多克隆抗体及单克隆抗体两种。由于单克隆抗体具有理化性质单一、特异性好、亲和力高并可以无限生产的特点，比多克隆抗体具有更大的应用价值。本发明首次通过制备单克隆抗体并建立起检测大肠杆菌分泌的β-葡萄糖苷酸酶的双抗体夹心法来实现对大肠杆菌的检测，为食品中大肠埃希氏菌的快速检测提供了新方法。

发明内容

（一）要解决的技术问题

  E.coli的血清型繁多，如何实现对绝大多数E.coli的检测是目前仍需要解决的问题。本发明的目的在于建立一种具有高灵敏度、高特异性、高准确度、高精确度、操作方法简单的酶联免疫吸附检测方法，通过检测大肠杆菌胞内β-葡萄糖苷酸酶从而实现食品中大肠杆菌的批量、快速检测。

（二）技术方案

为实现上述目的，本发明的技术方案：一种基于单克隆抗体的检测食品中大肠杆菌胞内β-葡萄糖苷酸酶的双抗体夹心法。本发明还包括对方法的优化。

大肠杆菌胞内β-葡萄糖苷酸酶作为大肠杆菌ELISA检测抗原的发现及证明。

通过文献查阅发现大肠杆菌胞内β-葡萄糖苷酸酶是广泛作为大肠杆菌标志物的一种酶，在饮用水、食品样品大肠杆菌的检测中作为大肠杆菌的检测目标。97%的大肠杆菌可以正常分泌β-葡萄糖苷酸酶。但以往的研究一般均采用显色平板或者分子生物学方法检测β-葡萄糖苷酸酶的基因MUG来检测大肠杆菌。本发明首次在蛋白水平实现了对大肠杆菌胞内β-葡萄糖苷酸酶的检测，从而间接检测大肠杆菌，本方法为大肠杆菌的检测提供了新的选择。

     （1）单克隆抗体的制备

以重组表达的大肠杆菌β-葡萄糖苷酸酶为免疫原，免疫 7周龄的BALB/c小鼠，进行免疫、融合、筛选，共筛选到10个细胞株；免疫程序如下：第一周进行首免，100μg/只，弗氏完全佐剂乳化后皮下多点注射；第四周进行二免，100μg/只，弗氏不完全佐剂乳化后皮下多点注射；第六周进行三免，50μg/只，弗氏不完全佐剂乳化后皮下多点注射；第七周尾部采血测效价，选择效价最高的老鼠；第八周进行冲刺免疫，20μg/只，生理盐水溶解，腹腔注射；冲刺免疫3天后眼眶采血后进行融合；筛选采用间接Elisa进行，共筛选到10个细胞株； 

重组表达的大肠杆菌β-葡萄糖苷酸酶，购自爱尔兰megazyme公司，货号120501；购买证明见证明文件1。

（2）单克隆抗体的配对筛选