[发明专利]一种检测食品中大肠杆菌胞内β-葡萄糖苷酸酶的双抗体夹心法有效

申请号：	201310691119.3	申请日：	2013-12-17
公开（公告）号：	CN103698521A	公开（公告）日：	2014-04-02
发明（设计）人：	匡华;胥传来;王文彬;徐丽广;马伟;刘丽强;宋珊珊;胡拥明	申请（专利权）人：	江南大学
主分类号：	G01N33/577	分类号：	G01N33/577
代理公司：	无锡市大为专利商标事务所 32104	代理人：	时旭丹;刘品超
地址：	214122 江苏省无锡市***	国省代码：	江苏;32
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摘要：
搜索关键词：	一种检测食品大肠杆菌葡萄糖苷抗体夹心
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【权利要求书】：

1.一种基于单克隆抗体的检测食品中大肠杆菌胞内β-葡萄糖苷酸酶的双抗体夹心法，其特征在于

（1）单克隆抗体的制备

以重组表达的大肠杆菌β-葡萄糖苷酸酶为免疫原，免疫 7周龄的BALB/c小鼠，进行免疫、融合、筛选，共筛选到10个细胞株；

重组表达的大肠杆菌β-葡萄糖苷酸酶，购自爱尔兰Megazyme公司，货号120501；

（2）单克隆抗体的配对筛选

将纯化后的10株单克隆抗体分别标记辣根过氧化物酶HRP，直接法鉴定标记成功后进行夹心法配对；配对参数如下：包被抗体5μg/mL；包被液为pH9.6、0.01M的碳酸盐缓冲液；以重组表达的大肠杆菌β-葡萄糖苷酸酶为标品，浓度为10ng/mL；标品稀释液为pH7.2、0.01M的PBS；酶标抗体稀释1000倍使用；在此条件下，实验成功得到了9对P/N值>5的配对；

（3）夹心法的建立

选择检测限稳定、灵敏的配对，即分别以10B6即细胞株9号CGMCC No.7209单抗为包被抗体和4F2即细胞株11号CGMCC No.7211单抗为酶标抗体建立夹心法；具体参数如下：

抗体包被浓度：5μg/mL，

包被液：pH9.6、0.01M的碳酸盐缓冲液，

标品稀释液：pH7.2、0.01M的PBS+0.1% Tween，

检测抗体浓度：1.6μg/mL，

反应时间：包被、封闭：37℃、2h；标准品：37℃、1h；检测抗体：37℃、1h；显色10min；

优化后大肠杆菌胞内β-葡萄糖苷酸酶夹心法LOD：0.012ng/mL；

（4）大肠杆菌裂解过程

裂解液配制：0.1M磷酸盐缓冲液，0.01% Triton 100，0.05% EDTA，pH7.2；

裂解过程：大肠杆菌经EC肉汤增菌，取增菌后的液体样品以液体样品︰裂解液体积比1︰9的比例加入到裂解液中，在室温下振荡15min，取100μL裂解后的样品进行大肠杆菌β-葡萄糖苷酸酶夹心法检测；

本方法检测大肠杆菌的LOD为3.27*10^4cfu/mL。