[发明专利]一种转录组测序方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种转录组扩增测序检测方法，特别涉及微量样品中能够同时覆盖含和不含多聚腺苷酸尾巴的核糖核酸种类的扩增测序技术。

背景技术

随着生命科学研究技术的发展，第二代高通量测序技术的开发，对生物体的研究越来越详尽和深入，发现生物体内同种细胞间往往存在异质性，这些个体的特征可能是影响和引导生物体发育的重要因素，所以对单细胞水平的分析越来越重要。尤其是对单细胞转录组的测序分析，可以直接反应不同细胞间的整体表达差异，反应细胞生长的调控状态。

细胞内的RNA主要包括带有poly(A)尾的mRNA(约占细胞全部RNA的5％)，不带poly(A)尾的核糖体RNA(rRNA，占细胞全部RNA的90％以上)。对细胞转录组的测序分析首先需要将不稳定的RNA通过体外逆转录反应变成较为稳定的DNA序列，然后进一步扩增富集样品，达到标准商业化方法建库的起始量。为了防止含量过多的rRNA污染，目前存在的单细胞转录组测序方法在逆转录中利用与poly(A)互补配对的寡聚胸腺嘧啶(olig dT)作为引物，使得引物只能与带有poly(A)尾的mRNA结合，不与不带poly(A)尾的rRNA结合。虽然该做法可以杜绝rRNA的污染，但是同时也将研究对象限定在了带poly(A)尾的RNA中，其中最为重要的一种是mRNA。随着对转录组研究的不断深入，发现细胞中还存在许多其他种类的不带poly(A)尾的RNA，比如长非编码核糖核酸(1ong-noncoding RNA，lncRNA)，环形核糖核酸(circular RNA)等，它们可能对细胞基因表达存在重要的调控作用，但在逆转录时以olig dT作为引物的转录组测序方法中，由于引物不与不带poly(A)尾的RNA结合，该部分RNA的信息无法获得。

另一方面，现有技术中的转录组测序往往针对大量细胞(总核糖核酸在微克级)进行，为减少rRNA干扰，在进行逆转录之前先用针对细胞中大量存在的rRNA的探针将其去除之后再进行后续的实验。而在少量细胞、甚至是单细胞的转录组测序时，由于去除rRNA的步骤而带来的其他RNA的损失是无法承受的。

发明内容

针对现有技术中存在的无法对转录组中不带poly(A)尾的RNA进行测序，尤其是无法对少量细胞转录组中不带poly(A)尾的RNA进行测序的问题，本发明提供了一种能够逆转录出所有种类的RNA并将其扩增建库的方法，该方法使用包含随机序列的“随机引物”进行逆转录，不依赖poly(A)尾，因此可以覆盖所有核糖核酸种类。同时，由于反应温度条件的控制，可以减少rRNA的污染。

本发明提供一种转录组测序方法，在RNA到cDNA的逆转录过程中所使用的引物包含随机序列和特定序列，随机序列位于特定序列的3’端，二者之间有0-5个碱基，随机序列由4-12个随机碱基组成，优选由6-8个随机碱基组成(A、T、G、c中任意组合成六-八聚体)，特定序列为5-30个碱基的同聚体，优选为10-20个碱基的同聚体，更优选为15个碱基的同聚体，特定序列的碱基选自A、G、C、T中任意一个。传统利用olig dT作为引物的方法中，由于引物结合位置都只能结合在mRNA链末端的聚腺苷酸尾巴上，导致绝大部分情况下能够覆盖的片段都在整条核糖核酸链的末尾段，不利于研究基因转录的完整性以及揭示可变剪切等现象。本发明的随机引物理论上可以结合整条核糖核酸链的各个部位，因此可以大大提高逆转录的均匀性，反映细胞中转录本的真实状态。虽然随机引物可以随机的与任何序列结合，但是由于引物本身设计在随机组合的4-12个核糖核苷酸之后连接5-30个胸腺嘧啶(T)，更倾向于结合具有poly(A)尾的RNA序列，使得利用本方法对核糖体核糖核酸的逆转录非常少(小于2％)，不对测序数据造成损失，同时同聚体的存在也很少引入引物多聚体等人为的污染。

在该方法中，无需去除核糖体RNA。

在该方法中，所述的引物还包括锚定序列，锚定序列为cDNA扩增步骤中PCR引物序列。

在该方法中，所述RNA起始量为少量，甚至为单细胞当量，RNA起始量为0.1pg-100ng，优选10pg-500pg。相应的细胞数量为1-10000个，优选1-100个，更优选1-10个。