[发明专利]大豆北方茎溃疡病菌的检测靶标及其LAMP引物组合物和应用

说明书

技术领域

本发明属于基因工程领域，涉及大豆北方茎溃疡病菌的检测靶标及其LAMP引物组合物和应用。

背景技术

大豆北方茎溃疡病菌（Diaporthephaseolorum var.caulivora）是北美大豆上最重要的毁灭性的病害之一。该病菌侵染植株后迅速发展形成茎杆环状损伤，并可导致正在生长的植株死亡。发病严重的田块有80%的植株受到侵染。由此造成的产量损失高达50%^[1-4]。近年来该病害发展迅速，除美国外，阿根廷、巴西、加拿大、巴拉圭和意大利、前南斯拉夫、克罗地亚等欧洲部分国家及地区都有发生为害的报道^[5-8]。

因其近年来在国外发生普遍、经济影响大、传入风险高且在我国尚未有发生的报道，我国将其列为重点关注的大豆上13种检疫性病原菌之一^[9]。为了阻止大豆拟茎点种腐病菌传播范围的不断扩大，使大豆南方茎溃疡得到控制，需要对其进行快速、准确地检测。

环介导等温扩增法（loop-mediated isothermal amplification，LAMP），是日本的荣研株式会社的Notomi等人于2000年开发的一种新型的核酸扩增方法^[10]，其特点是针对靶基因的6个区域设计4条特异性引物，在链置换DNA酶（Bst DNA polymerase）的作用下，60～65℃恒温扩增，15～60min即可观察结果，效率可达10⁹～10¹⁰个数量级，具有操作简单、特异性强、产物易检测等特点。在DNA合成时，从脱氧核酸三磷酸基质（dNTPs）中析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的镁离子反应，产生大量焦磷酸镁沉淀，呈现白色。因此，可以把浑浊度作为反应的指标，只用肉眼观察白色浑浊沉淀，就能鉴定扩增与否，而不需要繁琐的电泳和紫外观察。由于LAMP反应不需要PCR仪和昂贵的试剂，反应产物可通过是否形成白色沉淀（浑浊）或SYBR GREEN Ⅰ染色后的颜色变化来判断是否反应。随着技术的不断完善和发展，会在食品检测临床疾病诊断等领域有着广泛的应用前景[11,12]。

发明内容

本发明的目的在于提供一种大豆北方茎溃疡病菌的检测靶标序列Tef。

本发明的另一目的是提供该大豆北方茎溃疡病菌的检测靶标序列Tef的其特异性LAMP引物组合物。

本发明的又一目的是提供该大豆北方茎溃疡病菌的检测靶标序列Tef及其特异性LAMP引物组合物的应用。

本发明的目的可通过如下技术方案实现：

大豆北方茎溃疡病菌的检测靶标序列Tef，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

所述的大豆北方茎溃疡病菌的检测靶标序列Tef在检测或鉴定大豆北方茎溃疡病菌中的应用。

针对所述的大豆北方茎溃疡病菌的检测靶标序列Tef设计的特异性LAMP引物组合物，包括正向内引物FIP如SEQ ID NO.2所示，反向内引物BIP如SEQ ID NO.3所示，正向外引物F3如SEQ ID NO.4所示，反向外引物B3如SEQ ID NO.5所示。

所述的特异性的LAMP引物组合物优选还包含正向环引物LF如SEQ ID NO.6所示，反向环引物LB如SEQ ID NO.7所示。

所述的针对所述的大豆北方茎溃疡病菌的检测靶标序列Tef设计的特异性LAMP引物组合物在检测或鉴定大豆北方茎溃疡病菌中的应用。

一种用于检测大豆北方茎溃疡病菌的LAMP检测试剂盒，包含所述的特异性的LAMP引物组合物。

所述的用于检测大豆北方茎溃疡病菌的LAMP检测试剂盒，包含：由20mM正向内引物FIP、20mM反向内引物BIP，10mM正向外引物F3、10mM反向外引物B3，10mM正向环引物LF、10mM反向环引物LR，9.26%10xThermoPol Reaction Buffer、50mM MgSO₄、10mMdNTPMixture、5M甜菜碱、8000U/mL Bst DNA Polymerase Large fragment及超纯水组成的检测溶液。