[发明专利]流感病毒裂解疫苗的纯化方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，具体地说，涉及一种流感病毒裂解疫苗的纯化方法。

背景技术

流感病毒裂解疫苗纯化工艺是将灭活的流感病毒收获液经超滤浓缩、连续流离心、柱层析、裂解、去裂解剂、离心等工艺处理后，去除大部分的杂质蛋白，得到流感病毒抗原蛋白的过程。

目前国内生产的流感疫苗的纯化工艺大部分都采用区带转头密度梯度离心和柱层析的技术相结合进行纯化，或仅用密度梯度离心，或柱层析；由于普通的区带转头密度梯度离心机受单次容量的限制，在进行大规模生产时通常需采用分批多次的离心操作，操作繁琐，工作量大，且容易导致同批样品均一性差的问题。

发明内容

本发明的目的是提供一种新型的流感病毒裂解疫苗的纯化方法。

为了实现本发明目的，本发明的一种流感病毒裂解疫苗的纯化方法，将流感病毒株接种鸡胚，经培养收获病毒液，病毒液经灭活后进行超滤浓缩，所得超滤液用KII连续流离心机进行蔗糖密度梯度离心，得到超离液，对超离液进行超滤透析去除蔗糖后进行分子筛凝胶层析，获得的病毒纯化液用裂解剂TritonX-100和去氧胆酸钠进行病毒裂解，裂解结束后，通过超滤透析去除裂解剂，获得的裂解液离心去除杂蛋白，收集上清经过滤除菌后，即得纯化的流感病毒裂解疫苗原液。

前述纯化方法中，病毒液经灭活后经300-700KD膜包超滤浓缩。

前述纯化方法中，进行蔗糖密度梯度离心使用的蔗糖浓度为45%-60%。

前述纯化方法中，超离液经100KD膜包超滤透析去除蔗糖，透析使用的缓冲液为0.01mol/L PBS液。

前述纯化方法中，进行分子筛凝胶层析使用的凝胶为Sehparose4Fast Flow；洗脱液为0.01mol/L PBS液，洗脱速度为0.3-0.8cm/min，上样量为柱体积的2%-8%。

前述纯化方法中，向病毒纯化液中加入裂解剂TritonX-100和去氧胆酸钠进行病毒裂解，二者浓度为0.2%-1.0%。

前述纯化方法中，病毒裂解的条件为：18℃-26℃，裂解30-120min。

前述纯化方法中，裂解结束后，用0.01mol/L PBS缓冲液进行超滤透析去除裂解剂，透析体积为裂解液体积的40-70倍。

前述纯化方法中，获得的裂解液以2000-10000g离心1-4h去除杂蛋白。

具体地，本发明的流感病毒裂解疫苗的纯化工艺，包括以下步骤：

1、流感病毒灭活液经过300～700KD膜包超滤浓缩得到超滤液。

2、超滤液由KII连续流离心机蔗糖密度梯度离心，蔗糖浓度为45～60%，离心时间为1～3h，通过检测仪收集目标样品，得到超离液。

3、超离液经过100KD膜包超滤透析去除蔗糖得到脱糖液。

4、脱糖液按上样量为柱体积的2%-8%进行分子筛层析，所用凝胶为Sehparose4Fast Flow。洗脱液选用0.01mol/L PBS缓冲液，洗脱速度为0.3-0.8cm/min。收集样品可得纯化液。

5、纯化液经过稀释后控制总蛋白质含量在2000μg/mL以下进行病毒裂解，裂解温度为18-26℃，裂解时间为30-120分钟，裂解剂选用TritonX-100和去氧胆酸钠同时进行，二者浓度均控制在0.2%-1.0%。

6、裂解结束，采用0.01mol/L PBS缓冲液进行超滤透析去除裂解剂，透析体积为40-70倍。

7、透析液经过高速离心机进行高速离心，离心时间为1-4h，离心力为2000-10000g。

8、离心结束后的离心液通过除菌过滤得到流感病毒裂解疫苗原液。

本发明采用KII离心机连续流离心和柱层析两种方法相结合的工艺，与现有技术相比，KII连续流离心机设备容量大，适合大规模的生产需要，能很好的保证样品的均一性，该工艺对杂蛋白的去除率更高，可获得更纯的流感抗原。

采用双裂解剂TritonX-100与去氧胆酸钠同时进行裂解病毒，能保证流感病毒裂解完全，保证终产品的安全性。

病毒裂解以后采用了高速离心机进行二次纯化去除了残余的杂蛋白，使杂蛋白去除率更高，提高了产品活性比。

本发明提供的流感病毒裂解疫苗的纯化方法操作简便、离心容量大、适合大规模生产；由于双裂解剂和离心工艺的应用，使最终产品的活性比（血凝素含量/总蛋白质含量）大幅提高，接近亚单位疫苗的活性比，获得了高品质的流感病毒裂解疫苗产品。

具体实施方式