[发明专利]一种新型高度敏感的细胞内潜伏的人巨细胞病毒检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及医学和微生物学检测领域，尤其涉及一种新型、高度敏感的细胞内潜伏的人巨细胞病毒检测方法，可以在临床检验及相关研究中应用。

背景技术

人类巨细胞病毒（human cytomegalovirus，HCMV）属疱疹病毒科β属双链线性DNA病毒，具广泛细胞亲嗜性，能感染上皮细胞、内皮细胞、成纤维细胞、外周血单个核细胞及神经细胞等。人群HCMV人群感染十分普遍，90%以上的成年人都感染HCMV，绝大多数属于无症状感染。但新生儿宫内感染或围产期感染，常造成流产、死胎、胎儿畸形、发育迟缓、听力障碍、神经系统发育迟缓等。潜伏感染是HCMV重要生物学特征，一旦感染即可终生存在人体内。由于机体生理或病理状态变化，潜伏体内的HCMV可反复激活，进入增殖性感染阶段，对免疫力低下个体（如组织器官移植个体或艾滋病患者等）可严重威胁生命。因此建立一种高度敏感特异的细胞内潜伏的人巨细胞病毒检测方法至关重要。

目前对于人巨细胞病毒（HCMV）的检测方法主要有病毒分离、PP65抗原检测、血清IgM、IgG 抗体检测、核酸检测等方法。HCMV诊断的金标准是HCMV分离培养，但是HCMV在体外人成纤维细胞培养中增殖非常缓慢，复制周期为36-48h。HCMV初次分离培养，需一个多月才出现特殊的细胞，即细胞肿胀变圆、细胞及核巨大化、核周出现一轮“晕”的大型嗜酸性包涵体。金标准耗时，操作繁琐，设备要求高，但不能用于早期检测，而且即使分离结果阴性并不能完全除外HCMV活动性感染，因此不适于作为检测HCMV感染的常用方法。现在临床上HCMV感染的诊断主要依赖于抗体血清学（IgG、IgM）检测或血清抗原（PP65）检测。血清学检测方便简捷，但容易出现假阳性和假阴性，易受高浓度类风湿因子的干扰。而且HCMV感染细胞谱广，血清学诊断难以明确感染部位，经过激素和(或)免疫抑制剂治疗后，HCMV感染可能不出现或延迟出现IgM类抗体反应。EBV感染的病人CMV  IgM检测阳性，因为CMV与EBV均为疱疹病毒科，CMV IgM检测方法存在交叉反应。HCMV pp65 抗原检测是早期诊断 HCMV 活动性感染的较敏感指标，但技术要求较高，敏感性较核酸检测低且费时，且很难确定HCMV在组织、细胞中的潜伏感染。荧光定量 PCR 方法是近年来新兴的一种技术，有文献报道的可用于real-time PCR检测HCMV感染的靶基因有：pp65基、UL54、UL83、UL123、US17基因、UL75等。目前唯一商品化的人巨细胞病毒核酸定量检测试剂盒（PCR-荧光法）选择的是HCMV AD169病毒株中IE1基因的一高度保守的非编码区为扩增靶区域，但是检测敏感性尚待商榷。这些用于real-time PCR检测的基因检测阳性只能代表HCMV增殖感染，对于检测细胞内潜伏的HCMV不敏感，不能真实反映人体内HCMV感染的情况。

近年来的研究发现了一些HCMV潜伏相关的HCMV基因，如CLTs (cytomegalovirus latency transcripts) , LUNA (latent undefined nuclear antigen; UL81–82as)  , UL111A  以及 UL133-UL138 基因簇。但尚无研究分析这些基因在临床标本中的表达。为此，本发明通过对这些候选基因的分析，确定UL138作为目的检测基因，建立一种高度敏感特异的细胞内潜伏的人巨细胞病毒检测方法。

发明内容

本发明专利的目的是对于HCMV潜伏感染的细胞中得到的样品，提供一种新型、高度敏感的细胞内潜伏的人巨细胞病毒检测方法。此方法克服了常规方法的上述问题，应用此方法检测HCMV感染的敏感性和特异性较高，检测结果可靠，且可以反映细胞内HCMV潜伏感染的情况。

本发明专利的目的是对于HCMV潜伏感染的细胞中得到的样品，提供一种新型、高度敏感的细胞内潜伏的人巨细胞病毒检测方法。此方法克服了常规方法的上述问题，应用此方法检测HCMV感染的敏感性和特异性较高，检测结果可靠，且可以反映细胞内HCMV潜伏感染的情况。