[发明专利]一种新型高度敏感的细胞内潜伏的人巨细胞病毒检测方法在审
| 申请号： | 201310680241.0 | 申请日： | 2013-12-13 |
| 公开（公告）号： | CN103627822A | 公开（公告）日： | 2014-03-12 |
| 发明（设计）人： | 薛向阳;陈静;张丽芳;陈文静;叶璐璐 | 申请（专利权）人： | 温州医科大学 |
| 主分类号： | C12Q1/70 | 分类号： | C12Q1/70;C12Q1/68 |
| 代理公司： | 温州高翔专利事务所 33205 | 代理人： | 陈庆吼 |
| 地址： | 325035 浙江省温州市茶*** | 国省代码： | 浙江;33 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 新型 高度 敏感 细胞内 潜伏 巨细 病毒 检测 方法 | ||
1.一种高度敏感的细胞内潜伏感染的人巨细胞病毒（human cytomegalovirus，以下缩写为HCMV）检测方法，其特征在于：提取人外周血单个核细胞中的核酸，使用特异性外侧上下游引物进行第一轮PCR扩增，以第一轮的扩增产物为模板，使用特异性内侧上下游引物进行第二轮定量PCR扩增，以提高检测的敏感性及特异性。
2.如权利要求1所述的新型高度敏感的检测方法，其特征在于：其中前期样品中的核酸来自HCMV的UL138基因，可以是抽提的mRNA逆转录成的cDNA，也可以是抽提的DNA。
3.如权利要求1所述的新型高度敏感的检测方法，其特征在于：其中用于人巨细胞病毒核酸检测的内外侧引物序列分别为以下编号所示的序列或至少包含这些序列10个连续性碱基构成的寡核苷酸：
外侧上游引物：5’-ATGGACGATCTGCCGCTGAA-3’ （Seq No.1）
外侧下游引物：5’-TCACGTGTATTCTTGATGAT-3’ （Seq No.2）
内侧上游引物：5’-GCTTACCACTGGCACGACACCT-3’ （Seq No.3）
内侧下游引物：5’-TACTCCCCGTACAGCTCGCAAC-3’ （Seq No.4）。
4.如权利要求1所述的新型高度敏感的检测方法，其特征在于：其中第一轮PCR的反应体系是：10×PCR缓冲液2.5μL，dNTPs（2mM）2.5μL，外侧上下游引物（10μM）各1μL， 病毒模板1μL，Taq DNA聚合酶（1 U/μL）0.5μL，灭菌双蒸水补足至25μL。
5.如权利要求1所述的新型高度敏感的检测方法，其特征在于：检测人巨细胞病毒核酸时第一轮的PCR反应条件：预变性95℃ 5min，循环95℃ 30s，57℃ 30s，72℃ 1min共35个循环，延伸72℃ 10min。
6.如权利要求1所述的新型高度敏感的检测方法，其特征在于：其中第二轮定量PCR的反应体系是：2×SYBR Green PCR混合缓冲液10μL，内侧上下游引物（10μM）各0.8μL， plus solution 2μl，第一轮PCR扩增病毒核酸产物模板DNA 1μL，，灭菌双蒸水补足至20μL。
7.如权利要求1所述的新型高度敏感的检测方法，其特征在于：检测人巨细胞病毒核酸时第二轮的定量PCR反应条件：预变性95℃ 5min，循环95℃ 30s，57℃ 30s，72℃ 1min共40个循环。
8.如权利要求1所述的新型高度敏感的检测方法，其特征在于：不但可用于细胞内潜伏的HCMV检测，而且可用于游离HCMV的检测。
9.如权利要求3所述的新型高度敏感的检测方法，其特征在于：任一寡核苷酸的HCMV检测试剂盒及定量试剂盒。
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