[发明专利]一种快速鉴别普通高温放线菌的特异PCR方法

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学鉴别领域，具体涉及普通高温放线菌的快速鉴别方法。

背景技术

普通高温放线菌（Thermoactinomyces vulgaris）最早由Tsiklinsky于1899年发现，是细菌域（Eubacteria）-厚壁菌门（Firmicutes）-芽孢杆菌纲（Bacilli）-芽孢杆菌目（Bacillales）-高温放线菌科（Thermoactinomycetaceae）-高温放线菌属（Thermoactinomyces）的典型种，常见于高温堆肥等高温环境中，嗜高温，能产生丰富的菌丝和内生孢子。

普通高温放线菌产酶十分丰富，可以产生耐热的α-淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、DNA聚合酶、羧肽酶T和几丁质酶，在高温环境中可分解淀粉、普鲁兰糖、环状糊精、弹性蛋白、胶原蛋白、脂肪等底物，在淀粉深加工、皮革制造、高温堆肥生产以及分子生物学等领域中有重要应用。近年来，在芝麻香型白酒酿造微生物研究中发现普通高温放线菌为高温大曲中的优势菌种，其代谢产物对芝麻香型白酒特殊风味物质形成具有不可忽视的作用，因此，对高温大曲等高温环境中普通高温放线菌菌株的筛选鉴别具有重要实践意义。然而，普通高温放线菌与其近缘种之间在形态学特征、生理生化特征及16S rRNA基因序列方面均十分接近，应用常规技术鉴别繁琐费时，无法满足普通高温放线菌的筛选及其应用研究的要求，因此，目前亟需建立一套准确、快速的普通高温放线菌鉴别方法，为菌种的选育及其应用研究提供技术支撑。

 

发明内容

本发明的目的是提供一种可以快速鉴别普通高温放线菌的方法。

为达到上述目的，本发明设计了普通高温放线菌的特异PCR引物，进行特异PCR扩增反应，可扩增出普通高温放线菌的特征持家基因，实际扩增片段为733bp。

用于鉴别普通高温放线菌的引物序列如下：

上游引物109F：5'-GCGTGACGGGAAAATCTATC-3'

下游引物801R：5'-CATCACGGCTTTGTTAATAATC-3'。

本发明采用的技术方案如下：

1)        获取菌种基因组DNA；

2)        采用上述引物在PCR仪上进行PCR扩增；

PCR反应体系为50 μl，其中10×Taq reaction buffer 5.0 μL，引物（10μmol/L）各1.0 μl，10 μmol/L 的dNTP 4.0 μL，2.5U的Taq酶0.6 μL，DNA模板1.0 μL，dd H₂O 37.4 μL。

PCR扩增的反应条件分别为：

109F/801R：95℃预变性5 min，进入循环：94℃变性30s，48℃复性30s，72℃延伸80s，共35个循环，然后72℃延伸10min。

3)        PCR扩增产物用1%的琼脂糖凝胶进行检测。

4)        普通高温放线菌鉴别

    在紫外灯下查看电泳条带，在733bp处有电泳条带的为普通高温放线菌，在733bp处无条带为其它种。

本发明经过充分的前期试验筛选和优化，得到的引物特异性强，PCR扩增条件简单，采用简单PCR反应后，通过电泳检测便可快速鉴别普通高温放线菌，具有高效、便捷及成本低廉等显著优点。

 

附图说明

图1为普通高温放线菌的特异性引物设计示意图，其中有下划线的部分为扩增片段对应的核苷酸序列，有下划线的斜体加粗部分为所设计的引物特异性结合位点。 

图2为引物109R/801R的PCR扩增产物在1%琼脂糖凝胶中的电泳图谱，1-T.vulgaris DSM 43016，2-T.vulgaris ACCC 41061，3-T.vulgaris ZM60，4-L.sacchari DSM 43356，5-L.putidus DSM44608，6-B.thuringiensis CICC 22945，7-T.intermedius DSM 43816，8-B.licheniformis CICC 10101，9-L.tengchongensis CCTCC AA 208050，10- L.sediminis CCTCC AA 2011024，11-Blank，M-DL2000 marker。

 

具体实施案例