[发明专利]检测甘蔗梢腐病温度敏感型小种gx2的方法

权利要求书

1.一种利用分子检测方法检测甘蔗梢腐病（F.moniliforme）温度敏感型小种gx2的引物和探针组合FAM-gx2，其特征在于所述引物和探针组合为下列6个组合中的1个组合：

FAM-gx2第一组：

引物：FAM-gx2-F1：5’-CTGATCCGAGGTCAACATTCAG-3’

FAM-gx2-R1：5’-GCAGCTTCCATTGCGTAGTA-3’

探针：FAM-gx2-P1：5’-CGCGTACCAGTTGCGAGGGTTT-3’；

FAM-gx2第二组：

引物：FAM-gx2-F2：5’-ACTACTACGCAATGGAAGCTG-3’

FAM-gx2-R2：5’-AGCGTCATTTCAACCCTCAA-3’

探针：FAM-gx2-P2：5’-CAGCGAGACCGCCACTAGATTTCG-3’；

FAM-gx2第三组：

引物：FAM-gx2-F3：5’-CGCAATGTGCGTTCAAAGAT-3’

FAM-gx2-R3：5’-ACAACGGATCTCTTGGTTCTG-3’

探针：FAM-gx2-P3：5’-TTTGCTGCGTTCTTCATCGATGC-3’；

FAM-gx2第四组：

引物：FAM-gx2-F4：5’-GTACCAGTTGCGAGGGTTT-3’

FAM-gx2-R4：5’-CCTGTTCGAGCGTCATTTCA-3’

探针：FAM-gx2-P4：5’-CAGCGAGACCGCCACTAGATTTCG-3’；

FAM-gx2第五组：

引物：FAM-gx2-F5：5’-GGGCTTGAGGGTTGAAATGA-3’

FAM-gx2-R5：5’-TCGATGAAGAACGCAGCAA-3’

探针：FAM-gx2-P5：5’-AATCTTTGAACGCACATTGCGCCC-3’；

FAM-gx2第六组：

引物：FAM-gx2-F6：5’-TCATTTCAACCCTCAAGCCC-3’

FAM-gx2-R6：5’-GAGACCGCCACTAGATTTCG-3’

探针：FAM-gx2-P6：5’-CGCCGATCCCCAACACCAAAC-3’；

上述Taqman探针的5’端、3’端分别用FAM报导荧光染料和BHQ-1淬灭基团标记。

2.一种如权利要求1所述的引物和探针组合检测甘蔗梢腐病温度敏感型小种gx2的方法，包括提取病原真菌DNA、建立qPCR检测的反应体系、qPCR检测的反应程序、定量qPCR检测，其特征在于：

（1）提取病原真菌DNA：采集甘蔗梢腐病样品，经分离纯化培养病原菌的样品提取病原菌DNA；或直接提取病建交界处的叶片DNA；

（2）建立qPCR检测的反应体系：qPCR检测的反应体系为1/10体积的10倍PCR反应缓冲液；dNTP各0.1～0.5mmol/L；Taq DNA聚合酶0.1～5国际单位;Taqman探针0.1～0.5mmol/L；分离纯化的DNA模板液0.1～5μl,；一个组合的引物和探针，各0.1～2nmol/L；加无菌去离子水使总体积达到10～100μl；

(3)qPCR检测的反应程序：qPCR检测的反应程序为：90-100℃30-60s；90-100℃5-30s，50-70℃20-90s，20～50个循环，在每个循环的延伸结束时进行荧光信号检测，荧光模式设为FAM；

(4)定量qPCR检测结果：qPCR检测结果Ct值为0，表示样品未检出甘蔗梢腐病温度敏感型小种gx2。