[发明专利]一种基于荧光定量PCR与核酸酶GR-5相结合的铅离子检测方法

权利要求书

1.一种基于荧光定量PCR与核酸酶GR-5相结合的铅离子检测方法，其特征在于，包括：

（1）将核酸酶GR-5与互补DNA固定化至PCR反应容器的内表面，其中所述互补DNA含有核糖核苷酸；

（2）将待测样品加入到步骤（1）所得到的PCR反应容器中，其中，在铅离子存在时，在所述核酸酶GR-5的作用下，所述互补DNA在核糖核苷酸处发生断裂，以便产生短核酸链；

（3）利用柠檬酸缓冲液对所述PCR反应容器进行清洗，以便除去未固定化的核酸分子；

（4）向所述PCR反应容器中添加扩增引物，以便对固定的互补DNA进行实时荧光定量PCR；

（5）基于所述实时荧光定量PCR的Ct 值，确定所述样品中的铅离子浓度。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述核酸酶GR-5具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，并且所述SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的5’末端被生物素修饰。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述互补DNA具有SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述互补DNA具有下列序列：5’AATCTGGTTTAGCTACGCCTTCCCCGTGGCGATGTTTCTTAGCGCCTTACCACTrAGGAAGAGATGATT-3’，其中，rA为核糖核苷酸。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤（1）中，将核酸酶GR-5与互补DNA固定化至PCR反应容器的内表面进一步包括：

用戊二醛溶液对所述PCR反应容器进行处理；

用链霉亲和素对所述PCR容器进行处理；

向所述PCR反应容器中加入所述核酸酶GR-5与互补DNA，以便在所述PCR反应容器的内表面固定所述核酸酶GR-5与互补DNA。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤（1）进一步包括：

用20微升0.8%的戊二醛溶液在37摄氏度下对所述PCR反应容器进行处理5小时，并利用超纯水对所述PCR反应容器进行清洗；

用20微升溶解链霉亲和素的0.01M碳酸缓冲液在37摄氏度下对所述PCR反应容器处理2小时，其中链霉亲和素在所述PCR容器中的终浓度为12.5 ng/mL，并用PBST溶液进行清洗，其中，所述PBST溶液含有10mM PBS，pH 7.2，0.05% Tween-20；

向所述PCR反应容器中加入20微升浓度为10nM的所述核酸酶GR-5与互补DNA的混合物，在37摄氏度下反应40分钟，并且利用柠檬酸钠缓冲液进行清洗，其中所述柠檬酸钠缓冲液含有750mM NaCl，75mM C₆H₅Na₃O₇。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述待测样品中铅离子浓度不低于0.07ng/mL。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述待测样品中铅离子浓度为0.1ng/mL~50 ng/mL。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述引物组由下列引物构成：

上游引物：5’-AATCTGGTTTAGCTACGCCTTC-3’（SEQ ID NO：3）

下游引物：5’-GTAAGGCGCTAAGAAACATCG-3’ （SEQ ID NO：4）。

10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，基于下列线性方程，确定所述样品中铅离子的浓度：

y=0.91748x+6.90575，

y为所述实时荧光定量PCR的Ct 值，x为相应的铅离子浓度。