[发明专利]一种基于荧光定量PCR与核酸酶GR-5相结合的铅离子检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及化学领域，具体地，涉及一种确定样品中铅离子浓度的方法，更具体地，涉及一种基于荧光定量PCR与核酸酶GR-5相结合的铅离子检测方法。

背景技术

铅及其化合物是一种带有剧毒的全球性环境污染物之一。在汽车尾气、塑料燃烧的烟气、油漆、劣质儿童玩具、铅酸蓄电池、工业电镀、冶炼产生的废水中也有大量的铅，食品中的爆米花、皮蛋、锡箔纸包装的食物中也含有铅，这些铅最终富积在水中并无法降解，对环境生命体对人特别是对儿童的危害极大，其主要毒性效应是导致贫血、神经机能失调和肾损伤、生殖系统损伤等。由于人们对铅污染的高度关注，对铅离子的痕量检测技术要求也越来越高，铅离子含量指标成为被关注的热点之一。

对铅离子的检测方法主要有：原子吸收分光光度法、原子荧光光谱法、电感耦合等离子体发射光谱法、阳极溶出伏安法、示波极谱法、生物染色剂试纸法等。但这些方法往往还需要大量的预处理，增加了很多成本，而且对操作人员有很高的技术要求，所以对铅离子简便、快速的高选择性、高灵敏度的检测方法仍是不断探索和实践的方向。

因而，目前的铅离子检测方法仍有待改进。

发明内容

本发明旨在至少在一定程度上解决上述技术问题之一或至少提供一种有用的商业选择。

根据本发明的实施例，本发明提出了一种基于荧光定量PCR与核酸酶GR-5相结合的铅离子检测方法，其包括：（1）将核酸酶GR-5与互补DNA固定化至PCR反应容器的内表面；（2）将待测样品加入到步骤（1）所得到的PCR反应容器中，其中，在铅离子存在时，在所述核酸酶GR-5的作用下，所述互补DNA在核糖核苷酸处发生断裂，以便产生短核酸链；（3）利用柠檬酸缓冲液对所述PCR反应容器进行清洗，以便除去未固定化的核酸分子；（4）向所述PCR反应容器中添加扩增引物，以便对固定的互补DNA进行实时荧光定量PCR；（5）基于所述实时荧光定量PCR的Ct 值，确定所述样品中的铅离子浓度。该方法可以提出了一种全新的、简单快速的、高选择性、高灵敏性的生物传感器，用以检测样品中铅离子的浓度。

根据本发明的实施例，核酸酶GR-5是一种特异性识别Pb²⁺离子的核酸酶，在Pb²⁺存在的情况下，核酸酶的互补链会在其核糖核苷酸处即rA处裂解，产生两条短的核酸链。

实时荧光定量PCR技术是90年代中期发展起来的一种生物技术，该技术为进行基因定量的表达研究提供了有力地解决方法。实时荧光定量PCR的主要技术优势在于，它可以通过加入荧光染料实时检测PCR过程中扩增产物的积累，了解PCR产物动态增加的全过程。目前该技术已经在生物化学、生物技术等科学技术领域得到了广泛的应用。

根据本发明的实施例，利用核酸酶GR-5在金属铅离子存在的情况下，核酸酶的互补链会在其核糖核苷酸处即rA处裂解，产生两条短的核酸链。然后基于实时荧光定量PCR技术，开发了一种简便、快速、高选择性、高灵敏性的生物传感器，用以检测水中铅离子的含量，极大地提高了铅离子的检测限。

根据本发明的实施例，上述方法还可以具有下列附加技术特征：

在本发明的一个实施例中，所述核酸酶GR-5具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，并且所述SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的5’末端被生物素修饰。由此，可以进一步提高利用本发明方法进行铅离子浓度检测的效率和灵敏度。

在本发明的一个实施例中，所述互补DNA具有SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。并且所述SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列被核糖核苷酸rA修饰。由此，可以进一步提高利用本发明方法进行铅离子浓度检测的效率和灵敏度。

在本发明的一个实施例中，在步骤（1）中，将核酸酶GR-5与互补DNA固定化至PCR反应容器的内表面进一步包括：用戊二醛溶液对所述PCR反应容器进行处理；用链霉亲和素对所述PCR容器进行处理；向所述PCR反应容器中加入所述核酸酶GR-5与互补DNA，以便在所述PCR反应容器的内表面固定所述核酸酶GR-5与互补DNA。由此，可以进一步提高利用本发明方法进行铅离子浓度检测的效率和灵敏度。