[发明专利]巨大芽孢杆菌同化硝酸还原酶和亚硝酸还原酶基因及应用

说明书

技术领域

本发明涉及的是一种生物技术领域的基因及应用，具体是一种巨大芽孢杆菌同化硝酸还原酶和亚硝酸还原酶基因及应用。

背景技术

由于大棚、温室等是在人为改变传统露地的前提下形成的一种高度集约化的设施栽培，具有常年高温、高湿、无降水淋洗、高施肥、高产出、超强度使用等特点，与露天土壤相比，其特殊的生态环境与不合理的水肥管理从而导致土壤次生盐渍化。硝酸盐的积累既是设施栽培土壤次生盐渍化的主要特征之一，同时也是引起设施栽培作物生理障碍的主导因子，造成蔬菜作物生长受阻，产量减少以及作物体内硝酸盐的大量累积。由于次生盐渍化问题越来越严重，已经成为制约设施栽培生产的主要障碍因子，如何有效地控制和去除环境中硝酸盐成为当前研究的热点。

在整个氮循环中，土壤中的硝酸盐主要有三个去向，即通过同化硝酸盐还原（同化作用）、发酵性硝酸盐还原、呼吸性硝酸盐还原（发酵性和呼吸性硝酸盐还原共同组成异化硝酸盐还原）3种作用，所得产物分别为细菌等生物体内的有机氮化物、亚硝酸盐和铵盐、亚硝酸盐或NH₃或N₂O或N₂。同化硝酸盐还原是硝酸盐被硝酸盐还原酶还原成亚硝酸盐，亚硝酸盐被亚硝酸盐还原酶还原为氨，氨被同化成氨基酸的过程。

已有研究表明，细菌Bacilus subtilis硝酸盐的同化作用基因簇为nasABCDEF，硝酸盐转运子NasA负责将硝酸盐由生物体外转运至体内；硝酸盐还原酶NasBC将体内的硝酸盐还原成亚硝酸盐；亚硝酸盐还原酶NasDE进一步将亚硝酸盐还原酶还原成铵盐。随后在ATP供能下，谷氨酰胺合成酶(GS)将谷氨酸和NH₄+转换成谷氨酰胺，最终铵参与微生物体内到氨基酸的合成。所以，研究微生物的硝酸盐同化作用，提高同化作用的效率，在为作物提供更多、更有效的氮素营养这一重要目标的同时，还可适当降低异化硝酸盐还原的趋势，以减少致癌物质亚硝酸盐和臭氧层杀手、温室气体N₂O等的排放，符合“低碳”、“减排”的发展方向。

发明内容

本发明针对现有技术存在的上述不足，提出一种巨大芽孢杆菌同化硝酸还原酶和亚硝酸还原酶基因及应用，能够针对解决设施大棚土壤硝酸盐的去除问题。

本发明提供的基因对研究微生物硝酸盐同化作用机理具有重要的价值，同时为进一步研究环境中硝酸盐的去除提供理论基础。

本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明涉及一种编码同化硝酸盐还原酶Nas(assimilation nitrate reductase)的催化亚基nasC，其氨基酸序列如Seq ID No.1所示，由716个氨基酸组成。

本发明涉及一种编码同化亚酸盐还原酶NiR的大亚基nasD，其氨基酸序列如Seq ID No.2所示，由804个氨基酸组成。

本发明涉及一种基因功能表达方法，通过从巨大芽孢杆菌NCT-2中提取得到总RNA后进行cDNA合成，得到cDNA模板后经荧光定量PCR实现功能表达。

所述的基因是指：编码同化硝酸盐还原酶Nas的催化亚基nasC以及编码同化亚酸盐还原酶NiR的大亚基nasD。

所述的巨大芽孢杆菌NCT-2通过以下方式进行培养：无机盐培养基中加入不同量的KNO₃，使其浓度分别为：10、30和50mM，每个浓度设3个重复。阴性对照以(NH₄)₂SO₄为氮源，培养瓶放入培养箱30℃，180rpm培养。分别在2、4、8、12、24h取样。

所述的总RNA通过以下方式进行提取：按照Takara的RNAiso Plus试剂的说明书进行，基本实验步骤如下：将1mL RNAiso Plus试剂加入上述培养的细菌中，室温放置5min后，12,000rpm离心，取上清，加入0.2mL氯仿；用力振荡15s后室温放置2-3min，12,000rpm4℃离心15min；小心取出上清，加入等体积异丙醇，室温静置10min后，12,000rpm4℃再次离心15min；弃去上清，用70%乙醇洗涤沉淀后，室温干燥mRNA至半透明状；于55-60℃的水浴中用20-100μL无RNA酶的焦碳酸二乙酯(diethylpyrocarbonate,DEPC)水使RNA全部溶解；取少量于RNA的浓度采用Nanodrop ND-1000测定含量及纯度的测定，其余保存于-80℃冰箱。