[发明专利]克隆苹果BKI1基因和苹果BKI1基因编码区序列的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其是苹果BKI1基因和克隆苹果BKI1基因编码区全长序列的方法。

背景技术

油菜素内酯是一类对植物生长起调节作用的激素类物质，在调控植物茎的伸长、维管束分化、光合作用、育性以及植株对逆境的抵抗能力等方面起重要作用。

油菜素内酯不敏感受体1激酶抑制子1(Brassinosteroids-Insensitive 1 kinase inhibitor 1，BKI1)，是富含亮氨酸的激酶，其作用是与油菜素内酯不敏感受体1（BRI1）生成二聚体，阻断油菜素内酯信号转导途径。在拟南芥中过表达BKI1的转基因植株表现为矮化。

苹果是世界性果树，其产量名列果品的前三名。我国是苹果生产大国，栽培面积约2000万亩，产量超过2985万吨，面积和产量均居世界第一位。随着苹果产业的逐年扩大和集约化生产的需要，培养矮化新品种是目前苹果产业的育种目标之一。

发明内容

本发明的目的是提供一种克隆苹果BKI1（BRI1 kinase inhibitor 1）基因及苹果BKI1基因编码区全长序列的方法。

本发明提供的苹果BKI1基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

上述的苹果BKI1基因，其编码区序列如SEQ ID NO:2所示。

上述的苹果BKI1基因，其编码区序列的编码氨基酸如SEQ ID NO:3所示。

上述的苹果BKI1基因，所述的苹果为“寒富”苹果。

上述的苹果BKI1基因的制备方法，包括如下步骤：

1）提取苹果叶片中的总DNA；

2）提取苹果叶片中的总RNA，然后将总RNA反转录成cDNA；

3）分别以DNA及cDNA为模板，通过设计的特定引物，利用PCR方法扩增，得到PCR产物；

其中，所述的特定引物是：

上游引物P1:5’-ATGGAGTCGTCGAGGACGAG-3’；

下游引物P2:5’-TCAAATCTCATGACTGACCA-3’；

PCR反应体系为：20μL体系：

PCR反应程序为：94℃ 3min；94℃ 30s，58℃ 1min，72℃ 1min，35个循环；72℃延伸10min。

3）PCR产物经回收、纯化，克隆，测序得到DNA序列如SEQ ID NO:1所示的苹果BKI1

基因序列，cDNA序列如SEQ ID NO:2所示的苹果BKI1基因编码区序列。

本发明的有益效果是：本发明通过PCR及RT-PCR方法，首次从‘寒富’苹果中克隆了苹果BKI1基因序列及其编码区序列。本发明简单、快捷的获取了苹果BKI1基因及其完整编码区序列，填补了该基因在苹果上的空白，为进一步研究该基因在苹果上的功能奠定了基础。本发明经一次PCR即获得了基因全长序列，经一次RT-PCR即获得了基因编码区序列，相比较染色体步移和RACE技术而言，具有工作量小，成本低，效率高等优势。通过实验，将苹果BKI1基因转入烟草中，使其在烟草中表达，至转基因烟草植株开花后调查其株高，发现转基因烟草植株主干的伸长与对照相比，显著受到了抑制，过量表达BKI1基因起到了矮化植株的功能。同样，将苹果BKI1基因转入‘寒富’苹果，使其在苹果中过量表达，在大田培养4个月的转基因苹果与对照相比，表现显著的矮化趋势。因此，在烟草和苹果中，过量表达BKI1基因起到了矮化植株的作用。

附图说明

图1是“寒富”苹果BKI1基因全长序列的PCR扩增图；

其中，1：清水对照；2：100bpMarker；3：BKI1基因DNA全长序列；4：BKI1基因cDNA全长序列。

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。

一、提取苹果叶片组织中的总DNA和总RNA，然后将总RNA反转录成cDNA

1.组织采集

选取“寒富”苹果幼嫩叶片，取约0.1g，放入液氮罐中用于提取总DNA及总RNA。

2.DNA的提取

将0.05-0.1g幼嫩的苹果叶片快速置于液氮研碎，移入到1.5mL离心管中；

加入600μL预热的2% CTAB提取缓冲液（预热前加入12μL 0.4% β-巯基乙醇），于65℃水浴锅中恒温水浴30min；