[发明专利]含有苹果油菜素甾醇信号转导途径负调控基因BKI1的植物表达载体的构建

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学和生物技术领域，涉及苹果油菜素甾醇信号转导途径负调控基因BKI1及其植物表达载体的构建方法。

背景技术

油菜素甾醇（Brassinosteroids,BRs）是一种广泛存在于植物中的类固醇激素，在植物的生长发育过程中起重要作用。调控了植物生长发育的各个过程，包括细胞的伸长、细胞的分裂、衰老、维管束的分化、雄性育性和光形态建成，以及对生物和非生物胁迫的抗性等。

油菜素甾醇信号转导途径由多基因参与，其中，细胞膜上的BKI1蛋白是该信号途径的一个负调控因子，BKIl作为BRIl的底物，当细胞中甾类分子浓度低时，BKIl于质膜上和BRIl的同源二聚体相互作用，抑制BRIl与BAK1的相互作用，对BR信号转导途径起到抑制作用。当甾类分子与BRIl的胞外域结合时，诱导BRIl的磷酸化，BKIl与BRIl分离，从而激活BR信号传递途径，这与BR生物合成的反馈抑制相一致。过量表达BKI1基因的转基因拟南芥植株表现为株型矮化（Wang et al.,2006）。

苹果是世界性果树，其产量名列果品的前三名。我国是苹果生产大国，栽培面积约2000万亩，产量超过2985万吨，面积和产量均居世界第一位。随着苹果产业的逐年扩大和集约化生产的需要，培养矮化新品种是目前苹果产业的育种目标之一。

发明内容

本发明的目的是提供一种新的苹果油菜素甾醇信号转导途径负调控基因BKI1（BRI1 kinase inhibitor1）。

本发明的另一目的是提供含有该苹果油菜素甾醇信号转导途径负调控基因BKI1的植物表达载体及其构建方法。

本发明的技术问题可通过如下技术方案解决：

苹果油菜素甾醇信号转导途径负调控基因BKI1，其DNA序列如SEQ ID NO.1所示。

苹果油菜素甾醇信号转导途径负调控基因BKI1的克隆方法如下：以苹果幼嫩叶片为材料，利用CTAB法提取总RNA，反转录合成cDNA，设计特定引物扩增苹果油菜素甾醇信号转导途径负调控基因BKI1：

上游引物：5’-ATGGAGTCGTCGAGGACGAG-3’

下游引物：5’-TCAAATCTCATGACTGACCA-3’

以反转录的cDNA为模板，进行聚合酶链式PCR反应，产物连接到pGM-T载体，转化TOP10感受态细胞，进行序列测定，得到序列如SEQ ID NO.1所示的苹果油菜素甾醇信号转导途径负调控基因BKI1。

上述的苹果油菜素甾醇信号转导途径负调控基因BKI1，所述的苹果为“寒富”苹果。

含有苹果油菜素甾醇信号转导途径负调控基因BKI1的植物表达载体的构建，方法如下：

1)提取苹果叶片中的总RNA，然后将总RNA反转录成cDNA；

2)以cDNA为模板，通过设计的特定引物，PCR扩增得到上游和下游分别引入NdeⅠ和EcoRⅠ酶切位点的BKI1基因；

其中，所述的特定引物是：

上游引物P1：5’-CGCATATGGAGTCGTCGAGGACGAG-3’；

下游引物P2：5’-GGGAATTCTCAAATCTCATGACTGACCA-3’；

3)将带有酶切位点的BKI1基因，连接到克隆载体pGM-T上，转化TOP10感受态细胞，提取阳性质粒pGM-BKI1；

4)限制性内切酶NdeⅠ和EcoRⅠ分别对提取的阳性质粒pGM-BKI1和表达载体pRI101AN进行双酶切，将得到的BKI1基因片段插入到表达载体pRI101AN中，构建含有苹果油菜素甾醇途径号转导途径负调控基因BKI1的植物表达载体pOX-BKI1。

本发明的有益效果：

1.本发明构建的含有苹果油菜素甾醇信号转导途径负调控基因BKI1的植物表达载体，为首次报道，可直接用于农杆菌介导的遗传转化，获得BKI1超表达新种质。