[发明专利]一种含绿色荧光蛋白报告基因的植物表达载体及其构建方法和应用

说明书

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，特别涉及一种适合双子叶植物遗传转化的植物表达载体。

背景技术

植物表达载体是植物基因工程研究的重要组成部分。它是携带目的基因进入宿主细胞并进行扩增和表达的重要媒介。通过植物表达载体，外源目的基因可进入宿主细胞并高效表达，为阐明新基因的功能和利用基因资源改良植物性状奠定了基础。因此，获得稳定、高效的植物表达载体是进行遗传转化的重要前提。

将外源基因导入植物体后，对转基因植株的鉴定是关键的一步。常用的鉴定转基因植株的方法是对转基因材料进行PCR，PCR即聚合酶链式反应(polymer as chain Reaction)，是在体外对特定的DNA顺序进行扩增。将少量的扩增产物和分子标记(Markers)进行琼脂糖凝胶电泳，经溴酚蓝染色，在紫外光下观察，不同转化受体是否出现目的基因片段。具有目的基因片段的植株为转基因植株，未扩增出目的基因的为非转基因植株。PCR鉴定转基因植株的方法虽然简单，但是这个过程耗时较长，且步骤繁琐，可能会做很多无用功。因此，探索一种在遗传转化早期就可以鉴定出转基因植株的方法显得尤为重要。

发明内容

本发明要解决的技术问题是：构建一种简便快速鉴定转基因植株的植物表达载体，解决转基因植株鉴定困难的问题。

本发明所提供的含绿色荧光蛋白报告基因的植物表达载体，是以pRI-AN-101载体为骨架载体，将GFP基因插入pRI-AN-101载体，得到重组载体pRI-AN-101-GFP，然后对GFP基因的NdeⅠ识别位点进行定点突变，得到含GFP基因的植物表达载体，命名为pRI101-GFP。

本发明所提供的含绿色荧光蛋白报告基因的植物表达载体的构建方法，包含以下步骤：

1.GFP基因的获得：以pCXGFP-P载体质粒为模板，以SEQ ID NO：1所示的上游引物和SEQ ID NO：2所示的下游引物进行PCR扩增，得到GFP基因全长序列；

2.将GFP基因插入质粒pGM-T中，得重组质粒pGM-GFP；

3.用EcoR I和SacI分别对pGM-GFP和pRI-AN-101载体进行双酶切，将二者连接，得到重组载体pRI-AN-101-GFP；

4.以重组载体pRI-AN-101-GFP为模板，以SEQ ID NO：4所示的NdeⅠ识别位定点突变第一条引物和SEQ ID NO：5所示的NdeⅠ识别位定点突变第二条引物作为引物，进行PCR扩增，得到突变载体pRI101-GFP。

绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein，GFP)是一种可以发出绿色荧光的物质。GFP作为报告基因的优点：荧光产生不需要添加任何底物或辅助因子；相对分子质量小，对细胞无毒害；检测方便，可直接用于活体检测；无种属特异性及细胞种类和位置的限制；灵敏度高，不受假阳性干扰；可制成永久标本。但GFP也有在酸性环境下容易发生荧光淬灭，光漂白以及GFP生色团的形成对温度敏感等缺点。因为GFP基因自身含有NdeⅠ酶切位点，故将GFP基因作为报告基因导入植物表达载体pRI-AN-101中后，用双酶切法构建植物表达载体时，NdeⅠ酶切位点不能使用。然而NdeⅠ酶切位点在多数植物表达载体中不存在，并且该酶常见，经济实惠，在植物表达载体pRI-AN-101中用该酶切位点可以保留AtADH5’UTR（如图1所示），对目的基因的表达有一定的好处。因此为了使用NdeⅠ酶切位点，本发明对GFP基因自身的NdeⅠ酶切位点进行了基因的定点突变。

本发明所构建的植物表达载体pRI101-GFP具有下列优点：

1.能够简便快速的鉴定转基因植株；

2.可以活体鉴定转基因植株；

3.解决了NdeⅠ酶切位点在用双酶切的方法构建含绿色荧光蛋白基因植物表达载体时出现的问题，扩展了该植物表达载体的应用范围。

4.本发明的植物表达载体可以应用于双子叶植物遗传转化中。

附图说明

图1是植物表达载体pRI-AN-101的部分序列。

图2是GFP基因的电泳图。

图3是pGM-GFP和pRI-AN-101载体双酶切结果电泳图。

图4是pRI-AN-101-GFP重组载体的双酶切验证。

图5是NdeI酶切位点定点突变引物设计。

图6是大引物扩增结果。

图7是突变质粒质粒电泳检测结果。