[发明专利]一种基因重组菌发酵生产辅酶Q10的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种生产辅酶Q10的方法，尤其是涉及一种基因重组菌发酵生产辅酶Q10的方法。

背景技术

辅酶Q是一种天然存在的脂溶性醌类化合物，主要存在于原核生物细胞质膜和真核生物线粒体内膜中。结构上是由苯环和长度不同的类异戊二烯侧链两部分构成。由于不同生物中聚异戊二烯焦磷酸合成酶的编码不同，使得不同的生物体产生的辅酶Q种类各不相同。辅酶Q10是呼吸链上的一种电子传递体，具有抗氧化功能，广泛运用于心血管类疾病、肝炎、癌症、艾滋病等综合治疗及提高人体免疫力。

目前，辅酶Q10的生产方法主要有3种：动植物组织提取法、化学合成法和微生物发酵法。

1. 动植物组织提取法

动植物组织提取法曾经是辅酶Q10唯一的生产方法。该法利用了辅酶Q10广泛存在于动植物体内，特别是动物的肝脏内的特点。动植物组织提取法又可分为皂化法(醇-碱皂化法)、溶剂萃取法(醇-醚混合提取法)、吸附层析法等。

2．化学合成法

随着从废次烟叶中提取分离茄尼醇技术的成功及其工业化的实现，以全E式结构的茄尼醇为原料合成辅酶Q10的研究引起了化学家的广泛关注。目前，通过茄尼醇合成辅酶Q10主要有两条途径：一是茄尼醇经多步反应制备成癸异戊二烯醇衍生物，再与2,3-二甲氧基-5-甲基-1,4-苯醌（Q0）及其衍生物多步合成辅酶Q10的侧链直接引入法；二是用2,3-二甲氧基-5-甲基-1-4-苯醌（Q0)或四甲氧基甲苯先制备成含有异戊烯结构的中间体，再与茄尼醇衍生物经偶联、氧化合成辅酶Q10的侧链延长法。

3．微生物发酵法

20世纪70年代初期，就在化学合成法徘徊不前之际，人们想到了利用微生物培养获取辅酶Q10的方法，现已发现了很多产辅酶Q10的菌株。

与其它制备方法相比，微生物发酵法生产辅酶Q10具有不受原料限制，原料成本低，分离过程相对简单，不存在手性问题，易控制可实现大规模生产及发展前景广阔等优点。

但现有的应用于辅酶Q10生产的菌株产量都较低，难于实现大规模工业化生产。

发明内容

本发明要解决的技术问题是，克服现有技术的不足，提供一种基因重组菌发酵生产辅酶Q10的方法，与出发菌株相比，重组菌株能够有效提高辅酶Q10的产量。

本发明解决其技术问题采用的技术方案是，一种基因重组菌发酵生产辅酶Q10的方法，将一种与呼吸代谢、电子传递及能量转换相关的酶的基因转入高效表达还原性辅酶Q10的菌株。

所述与呼吸代谢、电子传递及能量转换相关的酶的基因为：NAD激酶基因。

所述高效表达还原性辅酶Q10的出发菌株为：类红球细菌（Rhodobacter sphaeroides）。

所述类红球细菌（Rhodobacter sphaeroides）保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心（简称CGMCC），保藏编号为CGMCC NO.1.2569。

所述的基因操作过程包括所涉及的目的基因的PCR扩增程序、表达载体的构建及检验方法、目的基因电转导方式。

所述重组菌的优化培养条件为：

（1）斜面活化（g/L）：葡萄糖 10-25，牛肉膏 5-15，酵母粉 5-20，氯化钠 5-10，琼脂粉 5-20，pH5-8，121℃灭菌20 min，确定无污染后接种重组菌，28-35℃培养2-8天；

（2）种子培养（g/L）：葡萄糖 10-30，玉米浆 5-20，酵母粉 5-25，硝酸钠 2-8，磷酸二氢钾 1-2，七水硫酸镁 0.2-1，pH5-8，121℃灭菌20 min，冷却后从活化好的斜面取一环菌体接种，25-38℃震荡培养5-32小时；

（3）发酵培养（g/L）：葡萄糖 30-80，玉米浆 5-40，酵母粉 5-25，硝酸钠 2-10，磷酸二氢钾 1-2，七水硫酸镁 0.2-1，一水硫酸锰 0.01-0.05，七水硫酸亚铁 0.01-0.05，生物素 （1-9）×10^-5，pH5-8，121-125℃灭菌20 min，接种量为1-10%，25-38℃震荡培养2-7天。

本发明通过前期发酵菌株代谢途径的分析，找到了影响菌株生产性能的酶，通过基因工程手段，采用一系列分子生物学技术，构建了新的基因工程重组菌，其辅酶Q10产量得到了显著的提升。进一步通过发酵培养基的优化，找到了适用于该重组菌的培养基，其辅酶Q10产量得到了进一步提升。