[发明专利]一种分离提取糜蛋白酶的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物制药领域，设计药用糜蛋白酶的生化分离技术。具体地说是采用盐析、多重结晶结合透析等技术来提取糜蛋白酶。

背景技术

糜蛋白酶是从牛胰腺或猪胰腺中分离纯化得到的一种蛋白酶。它在药理和临床上的功用主要有两方面：一、消炎：对各种炎症、炎性水肿、血肿、溃疡及血栓等有较好疗效。二、抗癌：能促进抗癌药物向病灶渗透，促使化疗药物发挥作用，局部大剂量使用时作用更强。大剂量使用可治疗多种肿瘤，如乳腺癌、宫颈癌、胃癌等，并且无任何毒副作用或不良反应。

中国专利CN1944641A公开了一种分离提取糜蛋白酶的方法，采用亲和层析工艺从糜蛋白酶原生产高纯度糜蛋白酶，但是正如中国专利CN1013025B分析，也存在一些缺点，最主要的，亲和层析介质昂贵，可重复使用次数少，介质的使用量大，不适合规模化大生产。而中国专利CN1013025B虽然解决了亲和层析的不足，也能获得高比活的糜蛋白酶，但同样，比较起传统工艺来，生产成本太高。可是随着糜蛋白酶的应用广泛，使得国际市场对本产品的需求不断扩大，质量要求上也更加严格，要求产品有更高的质量：《中国药典》(2010版)规定，糜蛋白酶的效价不得少于1000单位/毫克。针对效价提高的要求，本发明对传统工艺进行了改进和创新。

发明内容

本发明的目的就是为了生产高质量的糜蛋白酶而又降低生产成本，对传统工艺加以改造，尤其是参数的改造，提供了一种分离提取糜蛋白酶的方法，该方法包括如下步骤：

(1)结晶工序

投料：取糜蛋白酶粗品，按5～9ml/g的比例加水溶解，调pH值至2.5～3.5，搅拌8～10小时后，静置12～16小时。

结晶I

静置结束后搅拌，并调pH值至2.0～3.0。按1～3ml/g的比例加入饱和硫酸铵溶液，搅拌10～30分钟，调pH值至4.5～5.5，置20～28℃条件下，保温40～48小时，过滤，收集滤饼，滤液弃去。

结晶II

按2～4ml/g的比例加入水溶解滤饼，调pH值至2.0～3.0，再按0.5～2.0ml/g的比例加入饱和硫酸铵溶液，调pH值至4.5～5.5，置20～28℃条件下，保温20～24小时，过滤，收集滤饼。

结晶III

按2～4ml/g的比例加入水溶解滤饼，调pH值至2.0～3.0，再按0.5～2.0ml/g的比例加入饱和硫酸铵溶液，调pH值至4.5～5.5，置20～28℃条件下，保温20～24小时，过滤，收集滤饼。

结晶IV

按2～4ml/g的比例加入水溶解滤饼，调pH值至2.0～3.0，再按0.5～2.0ml/g的比例加入饱和硫酸铵溶液，调pH值至4.5～5.5，置20～28℃条件下，保温20～24小时，过滤，收集滤饼。

(2)活化工序

称量滤饼重量，按2～4ml/g的比例加入水溶解，调pH值至7.0～8.5。

再按0.5～1.5ml/g滤饼的比例加入磷酸盐缓冲液，搅拌，调节pH值至7.0～8.5。加入活化剂胰蛋白酶，比例为3～8mg/100ml料液，活化60～80小时。

(3)盐析工序

活化结束后调pH值至3.0～5.0，量取活化液体积，按400～600g/L的比例加入固体硫酸铵进行盐析，放置12～16小时。

过滤，弃滤液，收集滤饼。

(4)透析工序

滤饼按1～1.5ml/g的比例加入水，搅拌溶解，透析4～6天。

(5)冻干工序

收集、合并透析液，过滤，量取体积，调pH值至5.5～6.7，装盘、冻干。

与现有技术相比，本发明的优点和积极效果是：

本发明采用盐析、多重结晶结合透析等技术来提取糜蛋白酶，通过对传统工艺的改进和创新，不仅生产出了高质量的糜蛋白酶，同时又具有简单、低成本等优点。

本发明已建立起一套规模化的生产工艺，制备的糜蛋白酶精品效价高达1200单位/毫克以上，符合《中国药典》(2010版)要求，具有极大的市场竞争力。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。

实施例1

(1)结晶工序

投料：取糜蛋白酶粗品20.0g，加100ml纯化水溶解，并加适量2.5mol/L H2SO4溶液调节pH2.6，搅拌8小时后，静置12小时。

结晶I