[发明专利]双链接头、其应用及构建末端配对DNA文库的方法

说明书

技术领域

本发明涉及高通量测序技术领域，具体而言，涉及一种双链接头、其应用及构建末端配对DNA文库的方法。

背景技术

全基因组De novo测序也称为基因组从头测序，它不依赖于已有的序列信息，直接对某个物种的基因组进行测序，并通过生物信息学手段对序列进行拼接、组装，从而获得该物种的基因组图谱。通过对某物种全基因组序列进行系统研究，可以获得该物种基因组和重要的功能基因序列信息，解析该物种的进化史，阐明该物种生长发育、重要性状的产生以及适应环境的分子机制。

二代测序出现前，利用一代Sanger测序技术，若干个模式生物如：拟南芥、水稻、小鼠和线虫等的全基因组计划也得以完成。然而，这种测序技术速度慢、通量低、成本太过昂贵，远远不能满足科学家们对于全面解析众多具有重要科研和经济价值物种的全基因组计划的需求。随着454、IIlumina和SOLid等二代测序技术的出现，很多De novo测序项目由二代测序技术完成。在上述三种测序平台中，Illumina测序兼具高通量、准确性高、单位数据成本低等优点，在短序列拼接组装软件开发成功并广泛应用后，成为动植物基因组测序的首选。以李瑞强等为首的技术团队针对IIlumina测序技术开发了软件，开创了将短多长用于动植物基因组组装的先河，并利用此技术完成了多个重要基因组的组装，如熊猫基因组、黄瓜基因组、马铃薯基因组等。。基于这种二代测序的基因组De novo测序和组装方法，需要获得该物种梯度插入片段文库数据：180bp、300bp和500bp小片段文库数据以及2～20K来源于长插入片段两端末端配对（mate-paired）的基因组文库进行重叠群（contig）组装和基因组骨架（scaffold）拼接，DNA长插入片段的文库。基因组mate-paired DNA文库测序是通过长插入片段文库构建并测序，获得基因组中较大跨度段两端的序列。这种从较大跨度两端所获得的序列对较大基因组或者复杂基因组的组装和基因组结构变异发掘具有非常重要的作用。构建基因组末端配对（mate-paired）DNA文库的关键在于如何将长片段（2K，5K，10K，20K）两端成功实现分子内环化，并保证一定的环化效率。常规的mate-paired DNA文库的环化是通过平末端的分子内连接的方式连接实现的，这种建库方法不但环化效率低，而且测序后较难有效分辨哪些序列为来源于连接位点两端，给后期的基因组的比对和组装带来困难。

发明内容

本发明旨在提供一种双链接头、其应用及构建末端配对DNA文库的方法，以解决现有技术中Mate-paired DNA文库的构建方法不但环化效率低，而且测序后较难有效分辨哪些序列来源于连接位点两端的技术问题。

根据本发明的一个方面，提供一种双链接头。该双链接头包括接头A和接头B，接头A和接头B分别包括一个LoxP序列和将LoxP序列同方向地连接到待环化的DNA片段两端的辅助序列。

进一步地，接头A中的LoxP序列为正向LoxP序列，接头A中的辅助序列包括位于正向LoxP序列上游的粘性末端，以及位于正向LoxP序列下游的具有突出的3’T末端，接头A两条链的5’末端第一个碱基分别进行了磷酸化修饰，且正向LoxP序列的第32位碱基T进行了生物素标记；接头B中的LoxP序列为反向LoxP序列，接头B中的辅助序列包括位于反向LoxP序列上游的粘性末端，以及位于反向LoxP序列下游的具有突出的3’T末端，接头B两条链的5’末端第一个碱基分别进行了磷酸化修饰，且反向LoxP序列的第32位碱基T进行了生物素标记。

进一步地，接头A的碱基序列如图1所示，接头B的碱基序列如图2所示。

进一步地，双链接头包括：将图1中除正向LoxP序列外的碱基序列经过一个或几个碱基的取代和/或缺失和/或添加且具与接头A同样功能的核苷酸序列；以及将图2中除反向LoxP序列外的碱基序列经过一个或几个碱基的取代和/或缺失和/或添加且具与接头B同样功能的核苷酸序列。

根据本发明的另一个方面，提供一种上述双链接头在构建末端配对DNA文库中的应用。

根据本发明的再一个方面，提供一种构建末端配对DNA文库的方法。该方法包括用于构建末端配对DNA文库的DNA片段进行环化的步骤，用于构建末端配对DNA文库的DNA片段进行环化的步骤包括：将用于构建末端配对DNA文库的DNA片段与权利要求1至4中任一项的双链接头连接，得到连接产物；连接产物中的DNA片段采用Cre重组酶体系进行环化。