[发明专利]双链接头、其应用及构建末端配对DNA文库的方法

权利要求书

1.一种双链接头，其特征在于，包括接头A和接头B，所述接头A和所述接头B分别包括一个LoxP序列和将所述LoxP序列同方向地连接到待环化的DNA片段两端的辅助序列。

2.根据权利要求1所述的双链接头，其特征在于，

所述接头A中的所述LoxP序列为正向LoxP序列，所述接头A中的所述辅助序列包括位于所述正向LoxP序列上游的粘性末端，以及位于所述正向LoxP序列下游的具有突出的3’T末端，所述接头A两条链的5’末端第一个碱基分别进行了磷酸化修饰，且所述正向LoxP序列的第32位碱基T进行了生物素标记；

所述接头B中的所述LoxP序列为反向LoxP序列，所述接头B中的所述辅助序列包括位于所述反向LoxP序列上游的粘性末端，以及位于所述反向LoxP序列下游的具有突出的3’T末端，所述接头B两条链的5’末端第一个碱基分别进行了磷酸化修饰，且所述反向LoxP序列的第32位碱基T进行了生物素标记。

3.根据权利要求2所述的双链接头，其特征在于，所述接头A的碱基序列如图1所示，所述接头B的碱基序列如图2所示。

4.根据权利要求3所述的双链接头，其特征在于，包括：

将所述图1中除所述正向LoxP序列外的碱基序列经过一个或几个碱基的取代和/或缺失和/或添加且具与所述接头A同样功能的核苷酸序列；以及

将所述图2中除所述反向LoxP序列外的碱基序列经过一个或几个碱基的取代和/或缺失和/或添加且具与所述接头B同样功能的核苷酸序列。

5.如权利要求1至4中任一项所述的双链接头在构建末端配对DNA文库中的应用。

6.一种构建末端配对DNA文库的方法，包括用于构建末端配对DNA文库的DNA片段进行环化的步骤，其特征在于，所述用于构建末端配对DNA文库的DNA片段进行环化的步骤包括：

将用于构建末端配对DNA文库的DNA片段与权利要求1至4中任一项所述的双链接头连接，得到连接产物；

所述连接产物中的所述DNA片段采用Cre重组酶体系进行环化。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述构建末端配对DNA文库的方法具体包括以下步骤：

S1，将基因组DNA用物理方式随机破碎，富集用于构建末端配对DNA文库的DNA片段；

S2，对所述步骤S1中富集得到的DNA片段进行末端补平，然后末端加dATP，纯化；

S3，将所述步骤S2得到的产物和权利要求1至4中任一项所述的双链接头加入连接体系，进行连接反应；

S4，对所述步骤S3得到的连接产物进行电泳分离，切取目标条带，回收纯化；

S5，取所述步骤S4得到的产物采用Cre重组酶体系进行环化；

S6，对所述步骤S5中未环化的产物进行消化；

S7，对所述步骤S6中的产物进行破碎，使DNA片段大小集中在350～650bp之间；

S8，利用链霉素亲和磁珠对所述步骤S7的产物中带有生物素标记接头的序列进行富集；

S9，对所述步骤S8的产物进行末端修复，然后末端加dATP；

S10，对所述步骤S9的产物加测序所用接头；

S11，利用测序引物对所述步骤S10的产物进行PCR扩增；

S12，将所述步骤S11的产物电泳分离，切取350～650bp之间的DNA片段，回收、纯化，得到所述末端配对DNA文库。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述步骤S10中测序所用的接头为illumina测序所用的接头，所述步骤S11中的所述测序引物为illumina提供的P5和P7。

9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述步骤S5进一步包括，先将所述步骤S4得到的产物进行定量，然后取200～300ng所述产物采用Cre重组酶体系进行环化。

10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述步骤S9、S10及S11均在磁珠上进行。