[发明专利]一种抗草甘膦转基因大豆LAMP快速检测方法及应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种抗草甘膦转基因大豆LAMP快速检测方法及应用，属于生物技术领域。

背景技术

自1983年第一株转基因烟草问世以来，转基因作物的研究得到飞速发展，至今已有30年的历史。根据国际农业生物技术产业应用服务中心(ISAAA)2012年报告显示，转基因作物种植面积从1996年到2012年的17年间增长了100倍，由170万公顷增长至1.7亿公顷。2012年，发展中国家转基因作物的种植面积占全球的52％，超过了发达国家的转基因作物种植面积（48％），前五个种植转基因作物的发展中国家有中国、印度、巴西、阿根廷以及南非（Clive James,International Service for the Acquisition of Agri-biotech Applications,ISAAA.）在所有的转基因作物中，转基因大豆的种植面积超过其他任何转基因作物，占转基因作物种植面积一半以上。目前，至少有超过1000种抗草甘膦大豆品种在广泛应用(Lawton,K.,1999.Roundup of a market.Farm Industry News,February,pp.4–8)。

抗草甘膦（Glyphosate）转基因大豆由美国Monsanto公司1994年5月研制开发，在生产上迅速推广。抗草甘膦转基因大豆针对草甘膦的作用机理,导入能够使植物表达更多的EPSPS合成酶的基因,使植株对草甘膦不敏感从而能够忍受正常剂量或更高剂量的草甘膦而不被杀死。抗草甘膦大豆的种植使得田间杂草的管理措施发生巨大的改变，在解决粮食短缺、改善作物营养构成及缓解环境压力等方面带来了显著效益。但同时，转基因作物的种植的生态安全问题也受到人们的密切关注，有些学者认为转基因作物的种植会引起生态风险、基因漂移、影响生物多样性。我国虽然还未批准抗草甘膦转基因大豆的商业化种植，但作为草甘膦的生产和使用大国，抗草甘膦转基因作物在我国具有巨大的商业化应用潜力，因此，建立一套可靠、严谨而又简便的监管制度势在必行。同时，中国是全球最大的大豆进口国，转基因大豆的食品安全问题也成为人们相当关注的问题。2000年1月，113个国家在加拿大签署了联合国《生物安全议定书》，其中规定，消费者对于转基因食品拥有知情权，转基因产品越境转移时，进口国可以对其实施安全评价与标识管理（金芜军，贾士荣，彭于发.不同国家和地区转基因产品标识管理政策的比较[J].农业生物技术学报，2004,(12):7-12.）。2002年1月我国农业部颁布了《农业转基因生物标识管理办法》要求对转基因食品及含有转基因成分的食品实行产品标识制度。

目前的转基因大豆的检测手段有外源蛋白检测和外源基因检测。外源基因检测主要有两类。一类是检测非目的基因序列，包括启动子序列，终止子序列，以及克隆载体自身序列，例如P-35S,T-35S,T-NOS,或nptII。另一类是检测目的基因序列，例如内源基因Lectin，外源基因EPSPS等，主要方法有巢式PCR、RT-PCR、荧光定量PCR，Southern Blot等方法。这些方法操作繁琐，对仪器、试剂有较高要求，不适宜进行田间检测。

外源蛋白的检测方法都以免疫分析技术为基础，主要有酶联免疫吸附法（ELISA）以及胶体金快速检测试纸条法。ELISA技术特异性高，操作简便，且具有很好的稳定性和灵敏度。胶体金检测试纸条利用胶体金在碱性条件下带负电荷，与蛋白质分子的正电荷基团能通过静电吸引牢牢结合的原理而发明的一种新型免疫诊断技术。它的优点是简介迅速，结果易于判定，特异性好。除了上述蛋白检测技术以外，近年在基因芯片的基础上又发展出一种蛋白芯片技术。它是一种高通量监测系统，通过靶分子和捕捉分子相互作用来监测蛋白分子之间的相互作用，该技术为同时检测转基因植物中多种标志蛋白及与标志蛋白相关联的蛋白提供了有效手段。尽管这些蛋白检测技术已经运用于转基因植物检测中，但是，由于这些方法的检测范围狭窄，易出现假阴性结果，且价格比较昂贵，在日常检测中不易普及。