[发明专利]鸡抗菌肽β-防御素重组蛋白CBD的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体来说是一种鸡抗菌肽β-防御素重组蛋白CBD的制备方法。 

背景技术

防御素是一类富含半胱氨酸的阳离子活性肽，广泛分布于动物、植物和昆虫体内。由于其具有广谱的抗微生物活性，因此被命名为“防御素”(defensins)。体外抑菌试验表明，防御素能对革兰氏阳性和阴性细菌、真菌、分枝杆菌、螺旋体、披膜病毒等病原微生物产生较强的杀伤作用，构成宿主抵抗外来病原菌感染的第一道防线。 

防御素依据其半胱氨酸空间排布及二硫键大小和形成方式的不同，可分为哺乳动物防御素、昆虫防御素和植物防御素3种类型。哺乳动物防御素又分为α-、β-、θ-防御素3种类型。β-防御素最早从牛气管粘膜上皮中分离得到，广泛分布于人、鼠、牛、羊、猪的多种器官上皮细胞内。目前，在脊椎动物、无脊椎动物和植物中发现的防御素已超过500多种，Patil等报道了犬染色体基因组编码了42种β-防御素基因及其拟基因。目前，关于犬β-防御素的基因克隆在国内报道较少，靳慧君等报道了从健康西施犬睾丸组织中扩增出β-防御素基因，其基因在NCBI上检索名称为DEFB3L(cBD3)，并构建了真核表达载体，证实了其能在HEK293T细胞中得到表达。国外Sang等报道在犬的睾丸组织内克隆到了犬β防御素基因CBD1，并通过化学合成小肽的方法证实了其对革兰氏阳性、阴性菌有抑菌作用，对支原体也有抑制作用。 

随着耐药菌的出现，内源性的抗微生物肽越来越受到重视。β-防御素(β-defensin)作为抗菌肽的一种，借助其独特的生物学特性，极易被肠道吸收，也因其特殊的抗菌机制，不会诱导产生耐药性微生物。另一方面，动物食品安全越来越受到重视，使用无污染、无残留、无毒副作用的添加剂是解决该问题的关键。防御素是动物体成分之一，参与生命过程，是小分子短肽，具有安全 无毒副作用的生物学特征。用基因工程方法生产环保型β-防御素饲料添加剂，或通过日粮添加，对畜牧业生产具有极为重要的现实意义。 

发明内容

本发明的目的是提供一种鸡抗菌肽β-防御素重组蛋白CBD的制备方法。 

为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：一种鸡抗菌肽β-防御素重组蛋白CBD基因，所述基因序列如SEQ ID NO：1。 

进一步的：所述蛋白氨基酸序列如SEQID NO：2。 

本发明的另一目的是提供一种克隆抗菌肽β防御素重组蛋白CBD基因的引物，所述引物序列如下： 

SEQID NO：35’-ATGACGCTCATCATGATCGT-3’ 

SEQID NO：45’-TGATGTATAGATTGGTCATG-3’ 

本发明的第三个目的是提供一种鸡抗菌肽β-防御素重组蛋白CBD的制备方法，包括如下步骤： 

(1)鸡β-防御素基因CBD的克隆及测序； 

(2)表达载体的构建与鉴定； 

(3)重组蛋白的融合表达； 

(4)重组蛋白的鉴定； 

(5)表达产物的可溶性分析； 

(6)融合蛋白的纯化； 

(7)鸡重组蛋白的生物学活性检测。 

进一步的：所述步骤(1)鸡β-防御素基因CBD的克隆及测序包括如下步骤： 

①从鸡睾丸组织中提取总RNA，然后将总RNA反转录成cDNA； 

②设计引物及PCR反应，利用Primer5.0软件设计引物： 

SEQ ID NO：35’-ATGACGCTCATCATGATCGT-3’ 

SEQ ID NO：45’-TGATGTATAGATTGGTCATG3’ 

用cDNA为模板进行梯度PCR操作扩增鸡抗菌肽β-防御素重组蛋白CBD基因序列，PCR反应体系为25μL体系，反应条件为95℃预变性5min，94℃变性30s，55℃退火45s，72℃延伸2min，共35个循环，而后72℃延伸7min； 

③、PCR产物的回收和纯化； 

④、克隆； 

⑤、测序鉴定。 

本发明的有益技术效果是：本发明运用分子生物学技术，在国内外第一次鸡抗菌肽β防御素重组蛋白CBD；本发明操作难度小，可控性强，成本低，为防御素的免疫学研究及工业批量生产奠定了基础。 

具体实施方式