[发明专利]用于检测GDNF剪接变异体2、4的实时荧光定量PCR专用引物及方法

说明书

技术领域

本发明属于生物检测领域，具体涉及检测GDNF剪接变异体的实时荧光定量PCR的方法，特别涉及一种检测GDNF剪接变异体2（Gene code NO.：NM_001190469.1）和剪接变异体4（Gene code NO.:NM_199231.2）表达水平的引物。

背景技术

胶质细胞系源性神经营养因子（glial cell-line derived neurotrophic factor,GDNF）是一个研究历史较长的蛋白，最初在大鼠胶质瘤细胞株B49的培养基中分离出来，被认为可维持神经元的发育和再生，促进神经元轴突的生长(Lin et al.1993)。从蛋白质结构来看，GDNF属转化生长因子-β超家族成员（transforming growth factor-β,TGF-β)(Airaksinen and Saarma,2002)。距今为止，各国研究者对它的研究已接近20年，对其生物学作用也开展了多方面探索，认为该蛋白不仅仅以旁分泌途径作用于其他细胞，也以自分泌途径作用于自身，是一个具重要调节作用多效能营养因子。比如：在帕金森病动物模型和一些体外研究中，该因子保护多巴胺能神经元，是一个很重要的治疗帕金森病的候选因子(Lin et al.,1993;et al.,2000;Airaksinen and Saarma,2002)；在生殖方面的研究中，GDNF可在支持细胞中分泌，通过旁分泌途径对精原干细胞的增值和分化起具有决定作用（Guan et al,2006）。

人类GDNF基因位于5号染色体p12-p13.1区，含2个启动子、4个内含子和5个外显子（Baecker PA et al,1999，结构模式图详见图1）。该基因在转录过程中外显子4发生5’选择性剪切，同时由于存在两个启动子，可转录为不同的mRNA序列，其剪接模式详见图2。

在对基因转录过程中的产生的各种mRNA剪接变异体进行检测过程中，通常采用复杂且昂贵的杂交探针，相较于杂交探针的方法，采用荧光定量PCR具有快速、廉价和精确的特点，为达到检测基因的选择性剪接目的，适应于荧光定量方法，筛选出合适的引物以及适当的PCR扩增条件体系是关键。针对现有技术的检测发现，国内外尚未用于检测GDNF剪接变异体2、4（亦即pre-(β)pro-GDNF）的实时荧光定量PCR专用引物及方法的报道。

发明内容

为解决以上技术问题，需要开发专门用于检测pre-(β)pro-GDNF mRNA表达水平的实时荧光定量PCR专用引物及方法。本发明目的之一在于提供一种特异性引物，用于人组织或细胞内剪接变异体2（Gene code NO.：NM_001190469.1）和剪接变异体4（Gene code NO.:NM_199231.2）荧光定量检测(注：如背景技术所述，由于该两个剪接变异体存在相同的78bp剪接片段缺失，该种类型剪接变异体被称之为pre-(β)pro-GDNF，故以下均用pre-(β)pro-GDNF代表以上cDNA序列)。本发明的另一个目的在于提供一种用于检测人组织或细胞内pre-(β)pro-GDNF实时荧光定量检测的实时荧光定量PCR的方法。

本发明的目的是这样实现的：

一种用于检测pre-(β)pro-GDNF mRNA表达水平实时荧光定量的引物，其关键在于:其特异性双向引物，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。

特异性序列的引物序列为：

上游引物：CCGCCGGACGGGACTTTA(SEQ ID NO.1)，

下游引物：ATATTTGCGGCGGGCAGC(SEQ ID NO.2)。

一种用于检测人组织或细胞内检测pre-(β)pro-GDNF mRNA表达水平的实时荧光定量方法。其特征包括以下几个步骤：

人组织或细胞cDNA标准品的制备，以样品cDNA为模板，利用本发明提供的引物进行荧光定量PCR，建立实时荧光定量PCR的体系。

本发明提供的优选实时荧光定量扩增反应程序：

应用480System Real Time PCR扩增仪，95℃预变性30秒，1Cycle；95℃变性5秒，60℃退火20秒，72℃延伸10秒，40Cycles；