[发明专利]鉴定食品中鼠源性成分的试剂盒、制备方法及检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及鉴定食品中鼠源性成分的试剂盒、制备方法及检测方法，尤其是一种特异性好，灵敏度高的鉴定食品中鼠源性成分的试剂盒、制备方法及检测方法。

背景技术

近年来，不法商贩利用廉价的肉类冒充高价牛、羊肉的肉类掺假事件频发。更为严重的是，近期市面上出现了用来源不明的鼠肉冒充羊肉的恶性案例，引起社会各界广泛关注。鼠肉掺假不仅影响了肉类产品市场的正常运行，更造成了严重食品安全隐患。老鼠多生活于潮湿脏乱的环境中，携带多种细菌病毒。死鼠肉极易腐烂而滋生细菌，一些死鼠体内还含有老鼠药等强力毒药成分。因此，一旦老鼠肉被混掺入食用肉类及肉制品，食用后会造成人体中毒，轻则恶心、呕吐，重则可能导致死亡。 

以聚合酶链反应（PCR）为基础的检测技术已成为食品溯源，尤其是肉类种属鉴别的核心技术。该技术针对不同物种基因序列的差异，设计特异性的引物，利用PCR扩增反应实现食品中特征基因片段的指数级扩增，从而鉴别食品中的物种来源。实时荧光PCR的发展和应用提高了食品溯源方法的灵敏度，并为肉类及肉制品定量定性分析提供技术支持。目前，基于线粒体基因设计特异性的引物而建立PCR法和实时荧光PCR的方法已见大量报道，市面上已有许多利用此类方法检测肉及肉制品源性的试剂盒，在肉制品掺假控制与监管中发挥了重要作用。

然而，此类试剂盒多用于对肉制品中牛、羊、猪及禽类等源性的检测，而针对肉制品中鼠源性成分的检测的试剂盒还未有所见。在国外，已有运用普通PCR鉴别啮齿目物种源性的研究，但经过试验验证，该研究中针对啮齿目所设计的引物对猪、牛、羊等常见肉类均可以发生扩增反应，特异性差。在国内，目前市面上出现了针对海狸鼠源性成分的鉴定试剂盒。该试剂盒采用普通PCR方法，操作步骤繁琐，在灵敏度和特异性上都有一定的局限性。同时，在分类学上海狸鼠并不属于鼠科，而在国内某些地区，海狸鼠被视为可食用的肉类，因此使用海狸鼠掺假肉制品的危害性远小于本发明中调研选取的鼠科样本。

为了弥补鼠源性成分鉴定试剂盒的市场空缺，丰富肉制品掺假检测方法，我们开发了肉及肉制品中鼠源性成分检测的高灵敏度试剂盒。本发明针对生活中常见的可能掺假肉制品的鼠类，基于实时荧光定量PCR技术，设计鼠源性引物探针，具有良好的针对3种常见鼠肉的特异性，与其他肉类无交叉反应，灵敏度高达1皮克/反应，且总检测时间可控制在2小时以内，对肉制品掺假的监管和控制有着重要的意义。

发明内容

为了对肉制品掺假进行监管和控制，本发明提供了一种特异性好，灵敏度高的鉴定食品中鼠源性成分的试剂盒、制备方法及检测方法。

为实现该目的，本发明提供了一种鉴定食品中鼠源性成分的试剂盒，由以下试剂构成：

预混液1，其包含Taqman荧光定量PCR 反应Taq酶1.25U, dNTP各0.2μM，PH8.5的Tris-HCl 10 mM，KCl 50mM，MgCl₂ 1.5 mM；储藏条件为4 oC，保质期半年。

预混液2，其包含引物A 2μM, 序列为5'-CCGCCCAATCACCCAAA-3'，引物B 2μM， 序列为5'-GCCTCCGATTCATGTTAAGA-3'，序列荧光探针C4μM，序列为5'-FAM-TACTGAATYCTAGTAGCCAAC-TAMRA-3', 荧光探针D 4μM，序列为5'-CY5-TGGTCTTCTTAGCGAGAGTG-TAMRA-3'，以及内参核酸 0.005ng/μL；储藏条件为-20 oC，避光，保质期半年。

本发明还提供了一种鉴定食品中鼠源性成分的试剂盒的制备方法，包括以下步骤：

S21、提取常见鼠肉DNA并制作模板，进行扩增反应，对扩增产物进行测序；

S22、鼠肉测序结果与其他肉类DNA的同源基因比对，筛选出鼠类特异序列，设计相应的引物和荧光探针；

S23、设计阳性内参，消除反应体系中假阴性；

S24、验证方法的特异性，优化反应条件，制作试剂盒；

S25：使用梯度稀释的目标物种DNA，确定反应体系的检测灵敏度。