[发明专利]鉴定食品中鼠源性成分的试剂盒、制备方法及检测方法

权利要求书

1.一种鉴定食品中鼠源性成分的试剂盒，其特征在于，由以下试剂构成：

预混液1，其包含Taqman荧光定量PCR 反应Taq酶1.25U, dNTP各0.2μM， PH8.5的Tris-HCl 10 mM，KCl 50mM，MgCl₂ 1.5 mM；储藏条件为4 oC，保质期半年； 

预混液2，其包含引物A 2μM, 序列为5'-CCGCCCAATCACCCAAA-3'，引物B 2μM， 序列为5'-GCCTCCGATTCATGTTAAGA-3'，序列荧光探针C4μM，序列为5'-FAM-TACTGAATYCTAGTAGCCAAC-TAMRA-3', 荧光探针D 4μM，序列为5'-CY5-TGGTCTTCTTAGCGAGAGTG-TAMRA-3'，以及内参核酸 0.005ng/μL；储藏条件为-20 oC，避光，保质期半年。

2.一种鉴定食品中鼠源性成分的试剂盒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

S21、提取常见鼠肉DNA并制作模板，进行扩增反应，对扩增产物进行测序；

S22、鼠肉测序结果与其他肉类DNA的同源基因比对，筛选出鼠类特异序列，设计相应的引物和荧光探针；

S23、设计阳性内参，消除反应体系中假阴性；

S24、验证方法的特异性，优化反应条件，制作试剂盒；

S25：使用梯度稀释的目标物种DNA，确定反应体系的检测灵敏度。

3.如权利要求２所述的鉴定食品中鼠源性成分的试剂盒的制备方法，其特征在于，

步骤S21具体包括：反应体系为25μL，其中包括12.5μL premix Taq (2X, Takara, version 2.0), 0.5μL 10μM Seq 正、反向引物, 100ng 模板DNA 和ddH₂O；反应条件为95℃预变性3min；30个循环的95℃ 30s、50℃ 30s、72℃ 1min；72℃ 延伸7min。

4.如权利要求２所述的鉴定食品中鼠源性成分的试剂盒的制备方法，其特征在于，

步骤S22具体包括：探针的3’端用发光基团FAM标记，5’端用淬灭基团BHQ标记；在探针合成中等量分配两种碱基C/T。

5.如权利要求２所述的鉴定食品中鼠源性成分的试剂盒的制备方法，其特征在于，

步骤S23具体包括：阳性内参是由质粒pUC57插入一段重组基因构成；重组基因的序列为5’-CCGCCCAATCACCCAAATTGGTCTTCTTAGCGAGAGTGGCTGTCACGGGATTCGCTAAAATTCCCAGCGAAACCAGGCGGGAGTCTGGACACGTCGTTGGTACCATGATGAAGTGGCTGACATGATCACCGCGATGCGCCCAGGACATAATCTTAACATGAATCGGAGGC-3’。

6.如权利要求２所述的鉴定食品中鼠源性成分的试剂盒的制备方法，其特征在于，

步骤S24具体包括：反应体系为20μL，其中包括Taq酶1.25U, dNTP各0.2μM， PH8.5的Tris-HCl 10 mM，KCl 50mM，MgCl₂ 1.5 mM, 10μM引物A、B各0.4μL, 0.8μL 10μM 探针C, 0.8μL 10μM 内参探针D, 0.2μL ROX dye II (Takara, version 2.0)，100ng 模板DNA和 ddH₂O；反应条件为95℃预变性10min；30个循环的95℃ 5s、55℃ 30s、60℃ 20s。

7.一种鉴定食品中鼠源性成分的试剂盒的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

S31：取肉或肉产品中提取的DNA 1μL 与17μL 预混液1，2μL预混液2在冰上混合均匀；

S32：将混合好的试剂至于荧光定量PCR仪进行反应；

S33：当内参CY5荧光信号在Ct值35左右发生扩增，说明PCR体系反应良好。

8.如权利要求７所述的鉴定食品中鼠源性成分的试剂盒的的检测方法，其特征在于，

步骤S32具体包括：反应条件设为：95°C 预变性10 min, 40个循环的95°C 5s、55°C 30s，最后保存于4°C。