[发明专利]一种以蔗糖为原料生物转化生产甘露醇的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种表达蔗糖水解酶和甘露醇脱氢酶的重组菌株pET28a-sacA-mdh/BL21及其利用该菌株发酵生产甘露醇的方法，属于生物技术领域。 

背景技术

甘露醇（Mannitol）学名己六醇、木蜜醇，是一种六元糖醇，为山梨醇的同分异构体。分子式为C₆H₁₄O₆，分子量为182.17。甘露醇为无色、白色针状或柱状结晶性粉末，无臭，具有清凉甜味。熔点166℃，密度1.489g/cm³（20℃），易溶于水，溶于吡啶、苯胺和热的乙醇，几乎不溶于大多数常见的有机溶剂。与其他多元醇不同，甘露醇是唯一的具有不吸湿性的晶体。 

甘露醇被广泛应用于食品、医药、轻工和化工等领域。甘露醇的生产方法主要有天然提取法和化学催化法。自然界中还发现很多微生物菌株可以合成甘露醇，已报道的微生物类型有霉菌、酵母菌和细菌，具有甘露醇产率高且不产生山梨醇。对发酵法生产甘露醇的研究较多，从目前的研究来看，乳酸菌是最具有潜力的甘露醇生产菌，它能发酵产生高含量的甘露醇，尤其是异型乳酸菌的甘露醇脱氢酶更易于转化果糖生成甘露醇，但果糖作为底物相对昂贵，蔗糖相对便宜，能够利用蔗糖产生甘露醇，更具有生产前景。 

蔗糖水解酶[EC3.2.1.26(Sucrase)]能可逆地催化蔗糖水解成葡萄糖和果糖，由于果糖的甜度高，约为蔗糖甜度的1.36-1.60倍，在工业上具有较高的经济价值，因此人们对蔗糖水解酶的研究越来越多。甘露醇脱氢酶（mannitol dehydrogenase）是异型发酵乳酸细菌中合成甘露醇的唯一酶，一种依赖于NADH（EC1.1.1.67），另一种依赖于NADH（EC1.1.1.138），催化果糖与甘露醇的相互转化。在发酵中，蔗糖在蔗糖水解酶作用下生成等量的葡萄糖和果糖，葡萄糖用于能量代谢，而果糖可以在代谢中更多的转化为甘露醇，从而提高了甘露醇的转化率。且利用大肠杆菌发酵生产甘露醇，具有发酵周期短、稳定性高等优点。 

2010年，金红星等人以蔗糖为原料明串珠菌发酵生产甘露醇，但是甘露醇产量仅有7.31g/L。Korakli,Niklas von Weymarn等人分离或筛选出可高产甘露醇的乳酸菌，采用的碳源多为果糖-葡萄糖混合物或糖蜜-果糖浆混合液，产量较高，但均含有果糖的参与，且发酵周期较长，导致生产成本较高，不利于工业化生产。2009年，王芳等人将甘露醇脱氢酶在大肠杆菌中克隆及表达，以果糖为底物，果糖既用于能量代谢又用于甘露醇的转化，转化率为26.67%，转化率较低。最近，Badal C.Saha等通过实验，开发出一种成本更低的培养基用于培养Lactobacillus intermedius NRRLB-3693生产甘露醇，以糖蜜和果葡糖浆混合液为碳源发酵生产甘露醇。因此，寻找廉价的底物进行生物转化生产甘露醇，是当今面临的主要 问题。蔗糖是质优价廉的原料，分解后主要产生果糖基，对于那些经由果糖转化得到目的产物的生产工艺来说是优选的底物。因此，有效利用蔗糖中的聚合果糖和大肠杆菌的细胞工厂生物转化生产甘露醇，无疑是比较可行的路线之一。 

发明内容

本发明的目的是提供一株利用蔗糖生长并产甘露醇的重组菌菌株。构建得到的菌株发酵方法可行，易于控制，能将蔗糖中的聚合果糖有效地转化为甘露醇。并且利用该重组菌株进行发酵，甘露醇产量和产率高，缩短了发酵周期。 

本发明的另一个目的是提供一种利用上述大肠杆菌重组菌株生产甘露醇的方法。 

利用本发明所述的大肠杆菌pET28a-sacA-mdh/BL21发酵生产甘露醇的方法，具体步骤为： 

从LB板上挑取重组大肠杆菌pET28a-sacA-mdh/BL21单菌落接种于LB液体培养基中，37℃培养过夜，然后按1%-2%的接种量接种于100mL LB培养基中，37℃培养，OD₆₀₀达到0.5-0.8时，添加诱导剂IPTG0.05-0.2mmol/L后至少一次添加底物蔗糖，于22-25℃发酵培养8-12h，底物蔗糖的总量控制在110-180g/L。 

优选的按照如下几种方法进行发酵培养： 

先加入70-80g/L的底物蔗糖，22-25℃诱导培养5h后再添加35-45g/L蔗糖，培养5h。 

先加入35-45g/L的底物蔗糖22-25℃诱导培养3h后再添加35-45g/L的蔗糖，培养4h后补加35-45%的蔗糖，继续培养3h。