[发明专利]猪PDLIM3蛋白三种亚型超表达载体的构建和应用

说明书

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种猪PDLIM3蛋白三种不同亚型超表达载体的构建方法和应用。

背景技术

Actinin-associated LIM protein (PDLIM3) 属于PDZ/LIM 蛋白家族，其直接和α-actinin 蛋白在骨骼肌Z线处结合，最近发现其可以调控许多生肌调控因子myogenin 和MyoD。所以其可以作为肌纤维的结构蛋白也可以通过转录调控来促进肌纤维的发育。敲除PDLIM3可以导致心脏的发育不完善，并且带来许多肌肉相关的疾病，所以其在骨骼肌和心肌的发育过程中具有重要的作用。以前在人、小鼠、鸡和鱼类中研究报道PDLIM3基因存在两种不同的转录本。

猪PDLIM3基因是在大白猪和梅山猪中筛选出的骨骼肌差异表达基因，且为横纹肌特异表达基因，在骨骼肌发育不同时期和中外品种间表达量存在差异。研究还发现猪PDLIM3基因存在大量的转录本，除了包括以前发现的两种外，还发现一种缺失了中间ZM结构域的PDLIM3-2。以前的研究结果表明ZASP-like motif(ZM) 结构域对于ALP基因和肌肉Z线的结合起着重要的作用，表明ZM结构域在蛋白与蛋白结合中起着非常重要的作用，那么PDLIM3-2缺失了ZM结构域，可能会在蛋白与蛋白的相互作用中有着新的作用，特别是在肌肉的不同发育时期中可能起着某种重要的作用。另外还发现在3'UTR存在大量的选择性剪切现象，这很可能会改变其RNA二级结构，影响其转录从而改变其功能。

猪肌肉初级肌纤维数量形成终止和二级纤维形成的开始在胚胎期65天，出生后就是肌纤维的肥大增殖阶段。PDLIM3-1和PDLIM3-3在肌纤维数量肥大阶段，表达量呈现上调趋势，而在出生后他们的表达量显著升高，表明猪PDLIM3-1和PDLIM3-3可能对于肌纤维的增长和发育有重要的作用。然而PDLIM3-2在胚胎期65天具有较高的表达，而在出生后则表达量显著下降，说明 PDLIM3-2在猪肌肉纤维数量发育阶段发挥着重要的作用，特别是对二级肌纤维的形成。在体外分离培养的猪骨骼肌卫星细胞中也发现，随着肌卫星细胞的分化猪PDLIM3不同转录本都呈现上调趋势，说明不同的转录本在肌纤维的分化过程中起着重要的作用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种PDLIM3蛋白三种不同亚型超表达载体构建的方法。

本发明通过以下技术实现：根据pEGFP-N1载体的多克隆位点和猪不同PDLIM3转录本的编码区序列，设计带有保护性碱基、末端分别带有EcoR1和BamH1限制性内切酶酶切位点的引物，扩增产物包含猪不同PDLIM3转录本的编码区序列。将其构建入pEGFP-N1载体的EcoR1和BamH1两个酶切位点之间。得到猪PDLIM3不同绿色荧光蛋白融合表达载体pEGFP-N1- PDLIM3。

本发明的效果是：利用一对引物进行PCR扩增可以同时克隆猪PDLIM3蛋白三种亚型的基因的完整编码区，可以同时构建三个PDLIM3蛋白三种亚型超表达载体。该真核表达载体构建方法简单可行，可以高效的增强PDLIM3蛋白的表达，并且都包含绿色荧光蛋白，是研究猪PDLIM3蛋白三种亚型的功能差异的重要技术。

更详细的技术方案请参见《具体实施方式》中的实施例。

附图说明

序列表SEQ ID NO：1是本发明克隆的猪PDLIM3基因转录本1的核苷酸序列。

序列表SEQID NO：2是本发明克隆的猪PDLIM3基因转录本2的核苷酸序列。

序列表SEQID NO：3是本发明克隆的猪PDLIM3基因转录本3的核苷酸序列。

图1是猪PDLIM3蛋白三种亚型的绿色荧光蛋白融合表达载体pEGFP-N1- PDLIM3构建后的酶切鉴定图谱。图中泳道M：DNA分子量标准（DL2000 ladder）。

图2是猪PDLIM3蛋白三种亚型的绿色荧光蛋白融合表达载体pEGFP-N1-PDLIM3通过瞬时转染导入猪PK-15细胞后的蛋白表达图谱。A、B、C分别代表PDLIM3-1、 PDLIM3-2 和PDLIM3-3在细胞中的表达。

具体实施方式

实施例1: 猪PDLIM3蛋白三种不同亚型基因序列的扩增

（1）总RNA的提取

1. 将100mg肌肉组织放入盛有液氮的研钵中，用研杵将组织磨成粉末。