[发明专利]基于微悬臂梁平台的蛋白质模式识别方法

说明书

技术领域

本发明是基于微悬臂梁平台的一种蛋白质识别方法，采用了模式识别技术，利用蛋白质分子与不同化学基团之间的反应造成的微悬臂梁信号的变化，从而达到区分不同种类蛋白质的目的。本发明属于生物传感器领域。

背景技术

某些特定蛋白在体内的含量变化往往与某些疾病的发生发展密切相关，因此，一种具有高灵敏度和高准确性的蛋白质识别传感器将为疾病的早期诊断提供更大的便利。在蛋白质识别中，除了常规的“锁钥模型”识别，模式识别在传感器领域拥有很大的潜力。模式识别的方式最初得益于仿生学，模拟了哺乳动物的嗅觉系统，即当一种气味与鼻腔中的大量感应细胞相遇时，会产生一组交叉响应信号，根据这组信号的不同来区别不同的气味。

在传统的模式识别中，多采用光学或者电化学信号作为传感阵列的响应信号，而在本发明中，我们设计了一种基于微悬臂梁的传感阵列，能够将分子间的相互作用力转化成微悬臂梁的偏移距离的不同，这种偏移距离以纳米计，相当精准。

基于微悬臂梁的模式识别不需要在分子上修饰任何的标记物或外加探针，生物大分子可以不受任何标记物的影响，其自然属性得以完全保留；并且反应只需一步，可以快速检出；更重要的是，微悬臂梁有能力被设计成多通道识别的高通量系统，能够在一小时内识别出上千种蛋白分子。

截止目前为止，对于微悬臂梁的研究都停留在仪器本身的性能阶段，而对其的应用则远没有达到用于识别多种蛋白质，只有简单的单一物质检测，且应用并不广泛，有很大局限性，检测物质多受限于已知的特异反应。本发明开创了一种全新的方法，将力学信号响应应用于多种蛋白分子的识别，并不局限于已知的特异反应。它的特点就在于通过一组非特异反应信号，来区分不同的物质，尤其在疾病早期诊断中有着巨大的应用潜力。

发明内容

本发明针对传统蛋白质识别方法--抗原抗体识别法的不足，可适用于多种蛋白，尤其是无抗原抗体特异反应，或者抗体获得困难的蛋白分子的识别。

一种基于微悬臂梁的蛋白质模式识别方法，其特征在于：

基于微悬臂梁技术，将含有不同化学基团的化合物修饰于悬臂梁表面作为传感阵列，待测蛋白与该阵列接触反应，不同蛋白与该传感阵列间的分子相互作用力不同，从而造成微悬臂梁偏移中心的距离不同，通过测量这种距离，获得一组指纹数据，可区分不同蛋白；还利用了线性判别分析法分析多组指纹数据，证明了该方法可区分不同的蛋白质，具体步骤如下：

（1）传感阵列的制备

选用单面镀金的微悬臂梁探针，利用金与巯基之间的化学键，将6种带有不同化学基团的巯基化合物固定于微悬臂梁探针的镀金表面；这6种物质分别为：（3-巯基丙基）三甲氧基硅烷，11-巯基-1-十一醇，苄硫醇，1-十二硫醇，11-巯基十一烷酸，2-二甲氨基乙硫醇盐酸盐；当然也可以采用更多带有其他基团的化合物；

先将微悬臂梁探针置于无水乙醇中3分钟，后用紫外线照射5分钟灭菌；将此探针固定于修饰样品台上，每个梁分别浸入毛细管的一端，毛细管的另一端浸入待修饰溶液，利用毛细管的虹吸效应，使得不同的悬臂梁修饰上不同的巯基化合物；巯基化合物溶解于乙醇溶液中，浓度为100nM，修饰在室温进行，时间为30分钟；

（2）蛋白检测

将修饰好的传感阵列，微悬臂梁探针，置于检测池中，控制检测温度为25℃；先向检测池中冲入TE缓冲溶液（Tris-HCl 10mM, EDTA 1mM, NaCl 1M, pH7.4），静待微悬臂梁信号平稳，即空白曲线平稳后，加入0.1mg/ml的待测蛋白溶液，溶剂同为TE缓冲液；这时，所有的微梁都会由于结合了蛋白而向上或向下弯曲，根据蛋白与传感阵列上修饰化合物之间结合力的不同，微梁最终会达到不同的平衡值；

我们分别检测了6种不同的蛋白，数均分子量从11.7KDa到340KDa，等电点从4.47-7.8；微梁在5分钟以内达到稳定信号值；

本发明所采用的蛋白分别为：白蛋白Mw=68KDa, pI=4.7-4.9，细胞色素CMw=38KDa, pI=4.47-4.57，纤维蛋白原Mw=340KDa, pI=4.8，免疫球蛋白 GMw=150KDa, pI=7.4，脂蛋白Mw=38KDa, pI=4.9，枯草杆菌蛋白酶 BMw=27.6KDa, pI=7.8。

优选地，所述微悬臂梁的探针为镀金，或其他类型探针。

优选地，所述修饰于微梁上的化合物还可为DNA，或无机分子，或有机分子；其用于固定不同化合物的方法还可为抗原抗体反应，或DNA配对。