[发明专利]高效纯化量子点与IgG类单克隆抗体偶联物的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及纳米材料生物学修饰以及偶联物纯化的新方法。

背景技术

自从1975年应用细胞融合技术首次制备出单克隆抗体以来，杂交瘤技术得到了迅速发展。大量的单克隆抗体被成功制备，并被广泛应用于免疫学、生物化学、药理学、细胞生物学、微生物学及临床等各个领域。目前已制备了小鼠、大鼠及人的杂交瘤细胞株，其中应用最广泛的仍然是小鼠杂交瘤细胞株。因此，鼠源性IgG类单克隆抗体自然而然地成为了一类最主要且应用最为广泛的单克隆抗体。该类抗体不仅具有重要的科研价值，而且具有巨大的商业价值。然而，鼠源性IgG类单克隆抗体不具有类似纳米材料的光、电等性质，因此在实际应用中往往需要结合其他的一些材料，如荧光物质、有机染料，磁性材料等。

量子点(Quantum Dots, QDs)是一种由II-VI或III-V族元素组成的半导体纳米晶体 (Semiconductor nanocrystals)，由于量子点的极小物理尺寸，从而导致了一种量子限域效应，使得量子点显示出具有比常规有机染料、荧光蛋白更为优越的独特光学性质。首先，与常规有机染料相比，量子点的激发光谱宽且呈连续分布，其荧光发射光谱的半宽峰高与常规有机染料相比更窄，且呈对称分布。此外，量子点与常规荧光染料相比，激发和发射光谱之间的斯托克斯位移大，降低了量子点荧光信号的信噪比，大大提高了量子点的检测灵敏度。单个量子点的荧光强度是罗丹明染料的10-100倍之间，且量子点的荧光发射波长可通过调整量子点合成粒径的大小以及材料组分进行连续调谐，因此合成不同直径大小的量子点就能获得多种可以辨别的不同颜色荧光。由于不同尺寸大小的量子点能够采用单一波长的激发光产生不同颜色的荧光, 因而可方便实现对生物组分的多元检测。量子点与常规有机染料或荧光蛋白相比，具有较强的抗光漂白功能。量子点在连续光激发条件下，其荧光发射强度随时间变化不明显，而Alexa 488在没有添加抗漂白剂的情况下荧光强度呈指数下降。总之，作为一种新型的荧光标记物，量子点具有比常规有机染料以及荧光蛋白更为显著的优势，目前已广泛应用于细胞标记、活体细胞成像、活体动物体内荧光显微成像以及荧光标记的免疫学快速诊断技术等领域。其中羧基功能团表面的水溶性量子点应用最为广泛，采用多羧基以及疏水链的两性聚合物是油溶性量子点转化为羧基表面的水溶性量子点最常用方法。然而，量子点并不具有抗体分子的特异性和选择性，因此往往需要在其表面偶联上抗体分子形成量子点单克隆抗体偶联物。这样，这种偶联物就同时拥有了量子点的光学特性和抗体分子的特异性和选择性。

水溶性羧基化量子点与IgG类单克隆抗体常用偶联方法为EDC/NHSS介导的活泼酯方法。在水溶性羧基化量子点与IgG类单克隆抗体偶联过程中，将量子点IgG类单克隆抗体偶联物与溶液中游离IgG类单克隆抗体进行高效分离，是保证量子点IgG类单克隆抗体偶联物广泛使用的前提。目前，量子点单克隆抗体偶联物纯化方法主要包括以下几种。第一，超速离心方法。由于水溶性量子点纳米粒子粒径小，比表面积大，纳米材料与单克隆抗体偶联物表面含有大量的羧基，因此采用常规离心（低于30，000 g离心力），量子点单克隆抗体偶联物回收效率普遍偏低（小于50%），若要将量子点单克隆抗体偶联物回收效率提高至85%以上，离心速度一般需大于50，000 g。 第二种，凝胶色谱法。该方法利用量子点单克隆抗体偶联物与单克隆抗体的分子量差异（表现为光学以及水化粒径的差异），利用排阻层析原理进行分离。第三种，超滤分离法。该法利用超滤管的超滤膜截流分子量差异将单克隆抗体与量子点单克隆抗体偶联物进行分离的一种方法。同时还有基于琼脂糖凝胶以及琼脂糖-聚丙烯酰胺杂合凝胶电泳等的纯化分离方法。总之，利用以上纯化方法虽然可以获得较高质量的量子点单克隆抗体偶联物，但仍存在操作条件苛刻，流程复杂，得率低等缺陷，很难实现规模化生产。

发明内容

水溶性量子点是一种良好的纳米荧光标记材料，该材料通过与单克隆抗体、链霉亲和素、蛋白A、蛋白G以及配体或受体分子偶联，可广泛应用于细胞标记、活体细胞成像、活体动物体内荧光显微成像以及免疫快速诊断等诸多领域。但是传统的量子点单克隆抗体偶联物纯化方法存在操作条件苛刻，流程复杂，得率低以及很难实现规模化生产等缺陷。

本发明的目的是提供一种操作简便、分离效率高、大批量纯化水溶性量子点IgG类单克隆抗体的新方法，具体包括以下步骤：