[发明专利]一种抗肿瘤基因磁性复合纳米颗粒及制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种作为治疗癌症的辐射、热激诱导的双启动子pCDNA3.1-Egr1-Hsp70-HSVTK基因的构建及磁性复合纳米颗粒及其制备。

背景技术

近年来，许多新的基因治疗方法（包括辐射-基因治疗、基因-过热治疗）被相继运用于肝癌治疗研究中，其中应用较多、疗效较为肯定的目的基因是HSV-TK/GCV系统。它所采用的目的基因是自杀基因（Suicide gene）或称药物敏感基因，其治疗原理是可使无毒的药物前体（如GCV等）转化为有毒性的药物，通过掺入细胞DNA，阻断细胞DNA的合成，从而选择性地杀死快速增殖的肿瘤细胞。然而，在基因传递问题没有很好的解决以前，要实现全面的肿瘤基因治疗并获得理想的疗效是很困难的。病毒载体系统是迄今为止最有效的基因转移方法。但是，由于其局限性（如缺乏高效和定向的载体系统、基因进入体内的可控性问题等），尤其是安全问题的存在，使其临床运用受到严格控制；非病毒载体系统尽管避免了重大的安全隐患，但其转染效率一直不如病毒载体系统，难以获得有意义的基因表达。因此，如何突破基因转移瓶颈已成为基因治疗领域的当务之急。

随着纳米技术的发展，以纳米颗粒为基因转移载体的研究引起了广泛关注。纳米技术的出现为解决基因转移载体问题提供了新的思路。以纳米颗粒为基因转移载体就是将DNA、RNA等基因治疗分子包裹在纳米颗粒中或吸附在其表面，在细胞摄粒作用下进入细胞内释放基因治疗分子。国际国内已相继研制出多种纳米基因转移载体，并向着无机、有机以及生物材料杂化的趋势发展。本研究组也较早地涉足这一领域，并研制出具有自主知识产权的磁性锰锌铁氧体纳米颗粒、纳米磁性脂质体等多种磁性纳米载体。前期研究表明磁性纳米载体制备简单、无组织细胞毒性、易于表面修饰使其具有很高的生物相容性。磁性纳米载体除了具有一般纳米颗粒的特性以外，还具有超顺磁性，可在外加磁场的作用下，定向移动，从而进行靶向基因治疗。不仅如此，磁性纳米颗粒还可在外加磁场作用下磁感应升温用于肿瘤热疗。

放疗联合热疗治疗恶性肿瘤在20世纪80年代已经开始用于临床，随着研究的深入，对放疗联合热疗治疗恶性肿瘤的机制有了更深人的研究。放疗和热疗的联合应用，不仅可发挥各自的细胞毒作用，而且热疗有放射增敏作用。恶性肿瘤体积大，瘤体中心处于乏氧状态，对放射线抗拒，对瘤体周围的富氧部分敏感，因此在单纯放射治疗到一定程度后，肿瘤体积退缩程度减慢或不再退缩。而热疗可以抑制肿瘤细胞的呼吸，在乏氧状态下增强无氧糖酵解，使环境酸度增高，在酸性环境中，容易激活溶酶体的活性，抑制DNA、RNA和蛋白合成，使细胞膜破坏，骨架散乱，细胞功能受损，最后导致癌细胞死亡。相反，对肿瘤周围血液循环较好的细胞，由于难于达到有效热度，而疗效相对较差，但却是放疗的敏感区。s期肿瘤细胞对放射治疗抵抗最强，而对热疗却最敏感。因此，放疗和热疗联合治疗有疗效互补和相加的作用。热疗在放疗后30min进行，还可以抑制肿瘤细胞对放射线所致亚致死损伤和潜在致死损伤的修复，可以明显提高肿瘤的氧含量，增强肿瘤放射治疗的敏感性。

热激蛋白70（热休克蛋白70）启动子（Hsp70promoter）具有热激诱导性,其启动子序列经热作用（如42℃-45℃）后可诱导下游基因表达。Isomoto H等利用热作用诱导热激蛋白(heat stress protein)高表达的特点,将自杀基因与Hsp70启动子结合,构建相应腺病毒载体后导入细胞内，在热作用后高表达自杀基因,然后予以甘昔洛韦杀伤细胞,体外研究显示有显著杀伤作用。这种新方法被称为基因-过热治疗。本课题组构建了一种新型纳米磁性基因载体，将其与P1730OR（哺乳动物表达载体，编码β-gal，由热激蛋白70启动子驱动）结合制备成复合材料，在磁感应加热条件下可有效升温至43℃，β-gal表达强度随着温度的升高而明显增加。在此基础上，本组构建了热激启动子调控的pHsp-HSV-TK/As₂O₃复合磁性纳米粒，在磁感应加热条件下诱导自杀基因表达，并与As₂O₃（三氧化二砷）共同作用杀伤肝癌细胞。由于该载体为无机非病毒载体，加之本身所特有的磁感应升温控温特性，可使基因-过热治疗方法更为安全、稳定，也更方便实用。