[发明专利]一种条斑紫菜质体遗传转化载体的构建方法

说明书

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，涉及一种条斑紫菜质体遗传转化载体的构建方法。

背景技术

紫菜是目前经济价值最高的一种栽培海藻，我国是紫菜栽培大国，紫菜干品的年产量达到1.6万吨，长江以北以条斑紫菜(pyropia yezoensis)为主，长江以南，特别是福建、浙江主要栽培坛紫菜(Pyropia haitanensis)。近年来，随着栽培面积的扩大，紫菜养殖面临品种退化和病害频发的严峻局面。因此，利用现代分子生物学手段开展紫菜基因工程研究，培育紫菜抗逆新品种，是解决上述问题的重要途径之一。

(1)质体遗传转化的研究

高等植物细胞中，细胞核、质体和线粒体都含有DNA，它们构成了既相对独立又相互联系的三个遗传系统。自70年代初基因工程技术诞生以来，向细胞核导入外源基因的核基因转化技术已经广泛应用于重要农作物改良及分子生物学研究中。几十年来，核基因转化一直是植物基因工程的主要研究方向。然而，随着研究的深入进展，人们逐渐认识到核基因转化有其难以克服的弊端，例如：细胞核基因组大，背景复杂；导入的外源基因难以控制；外源基因表达效率低，后代不稳定；对于来自原核的基因必须加以修饰改造等等，这些问题严重影响着核基因转化技术的实际应用。为了克服核基因转化存在的某些不足，1988年Boynton等人独辟蹊径，以莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardii)为材料用基因枪向叶绿体中转化外源基因，使突变体成功转化为能进行光合作用的正常莱茵衣藻，首次证实了叶绿体转化技术的可行性。后来，Svab等人将此技术应用于烟草，获得了稳定的质体转化体，由此带来了高等植物质体遗传转化的研究高潮。质体遗传转化在一定程度上克服了核基因转化的不足，具有独特的优越性，例如：将未经改造的苏云金杀虫蛋白基因(Bt基因)转化烟草叶绿体，其表达量比核基因转化提高了50倍以上。近几年来，质体基因转化技术发展迅速，已开始成为植物基因工程中新的热点。目前实现质体遗传转化的物种有：衣藻、烟草、马铃薯、拟南芥、番茄、油菜、胡萝卜、棉花、大豆、矮牵牛、西兰花、莴苣、杨树、水稻、甘蓝、地钱、甜菜、茄子、小麦等。质体遗传转化过程一般分以下4步进行：(1)构建质体定点整合表达载体；(2)将含外源DNA的质体定点整合表达载体通过适当的转化方法导入质体中，使外源DNA整合到基因组中；(3)筛选成功转化的质体的细胞；(4)稳定质体转化株的繁殖和鉴定。其中，成功构建高效表达的遗传转化载体是质体遗传转化的前提。

在载体构建中，利用与质体基因组完全同源的两翼片段实现外源基因与质体基因组的同源重组。

表达载体具有宿主叶绿体基因组1-2kb大小的左侧和右侧的侧翼序列，用于通过同源重组将外源基因插入到叶绿体DNA中。在叶绿体基因组中的插入位点是由所选择的位于标记基因和目的基因两侧的叶绿体DNA片段决定的。高等植物中，叶绿体基因组成功实现定点整合的位点包括：trnV-3′rps12，trnI-trnA和trnfM-trnG。trnV-3′rps12和trnI-trnA位点都位于叶绿体DNA中25kb的反向重复序列区域，而插入这些位点的基因能够在反向重复序列区域被快速复制成两个拷贝。

构建的载体需要有自身调控转录和表达的能力，此功能的实现有赖于外源基因两侧的调控序列。

调控序列：叶绿体的基因表达水平主要是由启动子和5′端非翻译区元件决定的，因此，一个包含有核糖体结合位点(RBS)的合适的5′非翻译区是叶绿体表达载体的重要组成元件。为了通过转基因表达使蛋白大量积累，首先需要一个强启动子来保证高水平的mRNA。转基因mRNA的稳定性也是由转基因两侧的5′-UTR和3′-UTR序列保证的，转基因蛋白的积累依赖于插入到编码目的基因的开放阅读框上游的5′-UTR序列。最常用的5′-UTR是Prrn、psbA，常用的3′-UTR是atpA3′-UTR、rbcL3′-UTR、psbA3′-UTR即TpsbA。