[发明专利]一种条斑紫菜质体遗传转化载体的构建方法

权利要求书

1.一种条斑紫菜质体遗传转化载体的构建方法，包括以下步骤：

(1)构建含rrsB-trnI-trnA-rrsL同源重组片段的骨架载体，①质体同源重组片段的克隆，以条斑紫菜质体基因组为模板，用下述正向和反向引物XhoI-PyT-F1 5′-CCGCTCGAGGAATCACTGGGCGTAAA-3′ SacI-PyT-R1 5′-CGAGCTCTTCGCTAATGCTTCAAACTA-3′进行PGR扩增，所述正反向引物5′端分别添加了XhoI和SacI酶切位点和几个保护碱基，且所述正向引物是3′末端为序列1 5′端第1-18寡核苷酸序列，所述反向引物是3′末端为序列1 3′端第1-20碱基反向互补的寡核苷酸序列，将扩增产物与pMD19-T载体连接，转化感受态大肠杆菌DH5α，菌落PCR检测，得到重组质粒；②用XhoI／SacI双酶切pBluescript SK载体和步骤①中所得重组质粒，切胶回收2890bp和2500bp片段，用T₄ DNA Ligase连接，转化感受态大肠杆菌DH5α，菌落PCR检测，得到重组质粒，即含rrsB-trnI-trnA-rrsL同源重组片段的骨架载体；

(2)构建含抗生素筛选基因表达盒的条斑紫菜质体表达载体，①以条斑紫菜质体基因组为模板，用下述正向和反向引物ClaI-PypsbA-F1 5′-CCATCGATGCAAAAGTTTGTACGAGT3′HindIII-PypsbA-R1 5′-CCCAAGCTTCTACCTTATGCTGATTAT-3′对psbA序列进行PCR扩增，所述正反向引物5′端分别添加了ClaI和HindIII酶切位点和几个保护碱基，且所述正向引物是3′末端为序列4 3′端第1-18碱基反向互补的寡核苷酸序列，所述反向引物是3′末端为序列3 5′端第1-18寡核苷酸序列，将扩增产物与pMD18-T载体连接，转化感受态大肠杆菌DH5α，菌落PCR检测，得到重组质粒；②抗生素筛选基因的克隆，以-Control Vector为模板，用下述引物Afe I-cat-F1 5′-TCTGAGCGCTATGGAGAAAAAAATCACTGG-3′ Pac I-cat-R1 5′-GCTTAATTAATTACGCCCCGCCCTG-3′PCR扩增氯霉素乙酰转移酶基因cat基因，所述正反向引物5′端分别添加了Afe I和Pac I酶切位点和多个保护碱基，且所述正向引物是3′末端为序列2 5′端第1-20寡核苷酸序列，所述反向引物是3′末端为序列2 3′端第1-15碱基反向互补的寡核苷酸序列，将扩增产物与pMD19-T载体连接，转化感受态大肠杆菌DH5α，菌落PCR检测，得到重组质粒；③将上述步骤①和步骤②所得重组质粒用Afe I／Pac I双酶切，切胶回收3600bp和660bp片段，用T₄DNA Ligase连接，转化感受态大肠杆菌DH5α，菌落PCR检测，得到重组质粒，即含抗生素筛选基因表达盒的条斑紫菜质体表达载体；

(3)构建条斑紫菜质体基因组定点整合表达的载体，用ClaI／HindIII双酶切步骤(2)中所得的含抗生素筛选基因表达盒的条斑紫菜质体表达载体，回收cat基因表达盒，再用T₄DNA Polymerase补平，插入到经过AvrII单酶切、末端平化、去磷酸化的步骤(1)所得的含rrsB-trnI-trnA-rrsL同源重组片段的骨架载体中，最终构建成含筛选标记基因cat表达盒、用于条斑紫菜质体基因组定点整合表达的载体pYVC。

2.根据权利要求1所述的条斑紫菜质体遗传转化载体的构建方法，其特征在于，所述同源重组片段为rrsB-trnI-trnA-rrsL序列如SEQ ID NO：1所示。

3.根据权利要求1所述的条斑紫菜质体遗传转化载体的构建方法，其特征在于，所述抗生素筛选基因为氯霉素乙酰转移酶基因cat基因如SEQ ID NO：2所示。

4.根据权利要求1所述的条斑紫菜质体遗传转化载体的构建方法，其特征在于，所述调控cat基因转录和表达的启动子为条斑紫菜psbA启动子如SEQ ID NO：3所示。

5.根据权利要求1所述的条斑紫菜质体遗传转化载体的构建方法，其特征在于，所述调控cat基因转录和表达的3′非转录区为条斑紫菜psbA基因3′非转录区如SEQ ID NO：4所示。