[发明专利]直接发酵产妥布霉素工程菌及其构建和应用

说明书

技术领域

本发明属于基因工程与微生物发酵技术领域，涉及发酵法直接产生妥布霉素的工程菌及其构建和应用，是前一专利 “一株产氨甲酰妥布霉素工程菌及其应用”（201110333833.6）的进一步升级，实现了工程菌发酵终产物终止在妥布霉素上，且发酵过程同样不产生安普霉素和卡那霉素B，发酵代谢产物主要组分即目标产物妥布霉素，解决了生产过程中的关键技术瓶颈。 

背景技术

黑暗链霉菌是一株重要的氨基糖苷类抗生素产生菌，其发酵复合物总称为尼拉霉素，主要组分为安普霉素、氨甲酰妥布霉素和少量氨甲酰卡那霉素B，代谢调控非常复杂[Irina Borodina, Charlotte Scho¨ller, Anna Eliasson, and Jens Nielsen. Metabolic Network Analysis of Streptomyces tenebrarius, a StreptomycesSpecies with an Active Entner-Doudoroff Pathway. Applied and environmental microbiology , May 2005, p. 2294–2302]。安普霉素是一种结构非常独特的氨基糖苷类抗生素，其分子中含有一个稀有的双环辛二糖结构，不易被氨基糖苷类抗生素钝化酶所钝化，在畜禽养殖领域得到广泛应用。妥布霉素则是一种在临床上广泛使用的氨基糖苷类抗生素，主要应用于治疗由革兰氏阴性菌引起的严重感染，是治疗由绿脓杆菌引起的败血症的首选药物。此外，妥布霉素还具有抑制基因表达过程中mRNA翻译过早终止的作用，而翻译过早终止是引起囊肿性纤维化等分子遗传病的主要原因[Altamura N, Castaldo R, Finotti A, et al. Tobramycin is a suppressor of premature termination codons [J]. Journal of Cystic Fibrosis, 2013]，妥布霉素有望成为治疗该类遗传疾病的新型药物。因此，研究妥布霉素的生物合成，不断提升生产技术水平，降低生产成本，减少环境污染，提高产品质量，解决制造过程的关键技术困难，具有重要的现实意义、社会意义和产业化意义。 

目前国内外都无法采用发酵法直接生产妥布霉素，发酵法直接生产妥布霉素成了国际性科学难题，也是妥布霉素生产企业中的一个关键技术瓶颈，是生产全过程技术升级换代的拦路虎。当前，妥布霉素制备均是先从发酵液中的尼拉霉素复合物中，分离得到氨甲酰妥布霉素，再在碱性高温条件下水解，去除氨甲酰基后得到妥布霉素。由于尼拉霉素复合物组分多，化学结构相近，理化性质类似，生物合成途径交织复杂，因此，利用黑暗链霉菌生产氨甲酰妥布霉素，存在复杂的其它组分，特别是安普霉素和氨甲酰卡那霉素B等，不仅会降低氨甲酰妥布霉素的产量，还给氨甲酰妥布霉素的提取带来麻烦。此外，在氨甲酰妥布霉素水解制备妥布霉素过程复杂[洪文荣，郭养浩，石贤爱等. 妥布霉素化学提取精制特性研究, 中国药科大学学报，2000,31(4)，p304-308]，妥布霉素还可能进一步水解形成尼泊拉胺和卡那霉胺；卡那霉素B则可能进一步水解形成卡那霉胺和新霉胺，人为制造二次副产物。卡那霉素B、尼泊拉胺、卡那霉胺和新霉胺是妥布霉素生产过程中四种不可避免的杂质。因此，利用现有方法生产妥布霉素，提取精制工艺复杂、产品质量不稳定、生产周期长、生产成本高。因此，如果能实现对生产菌株的改良，直接发酵妥布霉素，则以上这些问题与困难将一一迎刃而解。