[发明专利]同时提高丹参中迷迭香酸和丹酚酸B含量的载体及其应用

说明书

技术领域

本发明属于药用植物基因工程技术领域，具体涉及到能够在丹参中同时提高丹参中迷迭香酸和丹酚酸B含量的载体及其应用。

背景技术

丹参(Salvia miltiorrhiza Bunge)是唇形科(Labiatae)鼠尾草属多年生草本植物，以根及根茎入药，是重要的大宗药材之一。丹参具有活血祛瘀、通经止痛和清心除烦等功效，在临床上主要用于心绞痛、高脂血症、缺血性中风、肝炎和痤疮等疾病的治疗，已取得良好疗效。丹参的主要活性成分可分为脂溶性的丹参酮类和水溶性的酚酸类。由于传统中药多以水煎服，因此迷迭香酸和丹酚酸B等水溶性酚酸类成分被认为是丹参中发挥药理活性的主要物质基础，受到研究者们的普遍关注。迷迭香酸于1991年由德国Nattermann公司将其作为抗炎、镇痛、解毒药物投放市场；丹酚酸B是丹参中含量最高且抗氧化性最强的活性物质，具有保护心脑血管、肝、肾、抗纤维化等多种药理活性。

随着对丹参主要活性成分及其药理作用的深入研究，以丹参为主要原材料的生物制剂被大批量投入生产用于临床治疗。由于丹参市场不断扩大，野生丹参资源日益减少，20世纪70年代中期丹参已经供不应求，我国大部分地区开始大面积人工栽培或引种。药用植物对土壤、气候、海拔等栽培条件要求严格，适宜人工栽培的土地面积十分有限，为了满足市场需求，重茬连作随之而来，导致丹参在栽培过程中病虫害加重，生理性死苗现象不断发生，威胁丹参主产区的持续性发展。同时，栽培丹参缺乏系统的选育和提纯复壮，导致丹参的种质资源混杂，药用成分含量不同，品种退化，严重影响了丹参的质量和产量。上述问题已经成为制约丹参药材产业发展的瓶颈。因此，采用植物细胞工程、基因工程和代谢工程等现代生物技术，通过提高丹参有效成分含量筛选优良丹参品种，已经成为保证丹参药材质量的优良性和稳定性，解决丹参供求矛盾，进一步扩大丹参国际国内市场的必要手段。

植物次生代谢途径交织成网，错综复杂，代谢途径中目标产物的积累水平有时远非一两个关键酶所能控制。研究表明，转录因子不仅在植物防御和逆境胁迫应答过程中发挥着承上启下的信号传递和调控的重要作用；也可通过调控植物次生代谢途径中多个关键酶基因的表达有效激活或抑制整条代谢通路，从而调节特定次生代谢产物的合成与否和积累水平。因此，信号途径和转录因子的应用为植物次生代谢基因工程开辟了新方向。推测若能在植物中转入转录因子的同时，抑制竞争性途径中关键酶基因的表达，可进一步提高目标代谢物的含量。本发明将构建过表达AtPAP1转录因子并同时RNA干涉SmCOMT基因的表达载体并转入丹参，通过一次转化实现了不同基因呈相反趋势的表达调控，提高丹参中迷迭香酸和丹酚酸B的含量，此项策略填补了该领域研究的空白，具有较强的创新性。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于克服上述技术中的不足，提供一种同时提高丹参中迷迭香酸和丹酚酸B含量的新方法。

解决上述技术问题所采用的技术方案包括下述步骤：

1、拟南芥PAP1转录因子（其核苷酸序列为SEQ ID NO.5）和丹参COMT基因（其核苷酸序列为SEQ ID NO.6）cDNA序列的克隆

采用Primer Premier 5.0软件，分别设计可扩增出AtPAP1转录因子和SmCOMT基因cDNA序列的引物。在AtPAP1转录因子完整编码框两端分别引入Bgl II和BstE II限制性酶切位点，上游引物序列为5’-AGATCTATGGAGGGTTCGTCCAAAGG-3’，下游引物序列为5’-GGTAACCCTAATCAAATTTCACAGTCTCTCC-3’；在SmCOMT基因编码框上游引物序列引入Xho I和BamHI限制性酶切位点，下游引物序列引入Kpn I和Cla I限制性酶切位点，上游引物序列为