[发明专利]花生青枯病菌环介导等温扩增检测引物及检测方法

说明书

技术领域

本发明属于农作物病害检测、鉴定及防治技术领域，具体涉及一种花生青枯病菌的LAMP检测引物及其快速检测方法，可用于花生青枯病菌的高灵敏度、快速的特异性分子检测，还可用于花生青枯病的早期诊断和病菌的监测和鉴定。

背景技术

花生青枯病是由Ralstonia solanacearu引起的一种细菌性维管束病害。该病害于1905年在印度尼西亚首次报道，随后在20多个国家和地区相继发生或出现报道。目前，主要以中国、印度尼西亚和越南危害较重。我国关于花生青枯病的报道始见于30年代后期，现在主要分布于中部和南方地区，每年全国实际病地面积在40万hm²以上，受危害程度居世界首位。花生青枯病发病率一般在10%－30%左右，减产20%以上；重病区发病率可在50%以上，甚至导致完全绝收。近年来有报道显示，花生青枯病表现出向北蔓延的趋势，给花生生产带来更大威胁。除引起减产外，青枯病的发生还会降低花生品质，并增加黄曲霉毒素的污染。同时，花生青枯病是一种土传病害，可经雨水、土壤、病残体等从发病区向未发病区传播，且其侵染能力强，在较短的时间内可造成植株枯萎死亡。随着设施农业的高度集约化生产，复种指数高，品种单一，导致该类病害的发生越来越严重。因此，开展花生青枯病菌的快速检测，对该病害的早期诊断和及时防治具有十分重要的意义。

目前，关于花生青枯菌的检测方法包括传统分离培养法、血清学和分子生物学等方法。青枯病菌的传统检测方法是采用选择性培养基对病原物进行分离纯化，然后进行一系列的生理生化实验进行诊断，该方法易受外界因素的影响且灵敏度较低。而应用血清学方法时血清的制备过程耗时耗力，且可能存在交叉反应，造成检测结果的假阳性，难以满足对花生青枯病诊断的实际需要。因此，建立一套快速、灵敏、准确的花生青枯病菌检测诊断技术不仅非常必要，而且十分迫切。

PCR技术为植物病原诊断提供了快速、灵敏、准确的新途径，然而目前PCR特异性检测技术仍然需要PCR仪、电泳和凝胶成像系统等昂贵的专业仪器和分子生物学试剂，且需要分子生物学专业实验人员操作，限制了PCR检测方法的推广应用。环介导等温扩增技术（loop-mediated isothermal amplification，简称LAMP）是2000年由日本荣研株式会社Notomi等人开发的一种新型循环恒温核酸扩增技术。LAMP反应针对靶基因的6个位点设计出4条引物，利用一种链式置换活性的DNA聚合酶（Bst DNA polymerase），在恒温条件下（60–65℃）保温30–90分钟，即可完成扩增反应。由于LAMP反应的高效性和等温快速扩增的特点，在90分钟内可扩增10⁹–10¹⁰倍，其扩增产物的检测一般采用荧光染料目测观察、琼脂糖凝胶电泳和浊度观察等方法。由于LAMP反应简单、快速、高效、经济等特征，因而具有极为广泛的应用前景。目前LAMP检测主要应用于人畜病原物、食品安全和环境卫生的检测，在植物病原菌检测中报道极少，将LAMP方法应用于花生青枯病菌的检测国内外均未见报道。

发明内容

本发明的目的在于提供花生青枯病菌的LAMP检测引物及其快速检测方法，本方法易于操作、特异性强、灵敏度高，可得到准确可靠的实验结果。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

花生青枯病菌的LAMP检测引物及其快速检测方法，其具体步骤如下：

1、LAMP引物的设计：根据花生青枯病菌的16S-23S rDNA ITS序列采用PrimerExplorer V4软件设计一种LAMP检测引物，包括一对外引物和一对内引物，引物序列如下：

外侧引物F3：5’-TCTTGATAAGGCGGGGGT-3’（SEQ ID NO:1）；

B3：5’-AAACACCGATCTCTCGATGC-3’(SEQ ID NO:2)；

内侧引物FIP：5’-CCAGTTCACGGCAAGATCGCTTTCAAGTCCTACCAGACCCA-3’(SEQ ID NO:3)；

BIP：5’-ACCTGCTTTGCAAGCAGGGG-GCGTTTGGCTACCACAAGG-3’(SEQ ID NO:4)。

2．花生青枯病菌快速检测体系的建立：

1）采用NaOH快速裂解法提取花生青枯病菌的DNA，具体步骤如下：

a. 将花生病茎用清水洗净、晾干；