[发明专利]水蛭指纹图谱的建立方法及其标准指纹图谱

说明书

技术领域

本发明涉及一种水蛭指纹图谱的建立方法，以及由该方法所得的水蛭标准指纹图谱，属于中药分析领域。

背景技术

水蛭为水蛭科动物蚂蟥Whitmania pigra Whitman、水蛭Hirudo nipponica Whitman或柳叶蚂蟥Whitmania acranulata Whitman的干燥全体，夏、秋两季捕捉，用沸水烫死，晒干或低温干燥，其味咸、苦，性平，归肝经，有小毒。中医认为水蛭是一味传统的破血药，有逐血瘀、通经脉、利水道的功效。水蛭在临床上有着广泛的应用，以水蛭治疗的临床疾病主要有：慢性肾炎、经脉曲张、前列腺炎、不孕、糖尿病、癌症、心脏病、肝硬化、高血压、高血脂症、脉管炎、女子血闭、结膜炎与白内障、哮喘等；同时，水蛭体内含有水蛭素、组胺样物质、肝素、抗血栓素等多种药效成分，对于消除手术后引起的后遗症、阻碍血液凝固、促进血液循环亦有重要作用。中国专利CN101412726A公开了从蚂蝗中分离得到3个新杂环类化合物水蛭胺A、B、C，并进行了药效学试验，结果表明新化合物具有抗细胞缺氧及抗肿瘤细胞作用，其中化合物C的抗肿瘤细胞作用较强，化合物A和B化合物的抗细胞缺氧及抗肿瘤细胞作用均很强。

目前，国内外上市的中成药中，有一部分就是含有水蛭或水蛭提取物的制剂，这类制剂主要用于治疗心脑血管疾病，并取得了良好的效果，如脑血康颗粒、蛭龙血通胶囊、脑血康滴丸、复方水蛭口服液、芪参胶囊、通心络胶囊等，可见，水蛭具有多种药理药效作用，有着广阔的临床应用前景。但是，由于对水蛭中化学成分研究不充分，导致现有的药品标准中对水蛭或水蛭提取物的质量控制方法大多为浸出物检查、薄层鉴别等。例如，《中华人民共和国药典2010版一部》水蛭药材标准中采用水蛭对照药材薄层鉴别，其含量测定也只是粗略地记录水蛭浸出物消耗凝血酶的体积，以中和一个单位的抗凝血酶的量为一个抗凝血酶活性单位，其中规定，每1克水蛭含有抗凝血酶活性应不低于16.0U，蚂蝗、柳叶蚂蝗应不低于3.0U（式中的U为每1克含凝血酶活性单位，U/g）。以上鉴别或测量水蛭药材的方法，缺乏对水蛭中有效化学成分的定性鉴别和含量测定，专属性差，不能有效地控制水蛭及含有水蛭制剂的质量。

中药指纹图谱技术是目前国内外公认的用来控制中药、天然药物或中药材整体质量最有效、最准确、最直接的手段，是一种综合的、宏观的和可量化的鉴别方法，其基本属性是“整体性”和“模糊性”。“整体性”是指完整地比较色谱的特征“面貌”；“模糊性”强调的是对照物与待测样品指纹图谱的相似性。运用指纹图谱技术可以鉴别中药材和中成药的真伪，评价原料药材、半成品和成品质量的均一性和稳定性。对于用指纹图谱来控制水蛭药材的质量，国内已有专利及文献报道，例如，中国专利CN1844911A公开了水蛭指纹图谱的建立方法并公开了特征指纹图谱，但其以生理盐水室温浸泡16小时提取水蛭中的成分，试验周期长，生理盐水或水不能有效提出水蛭中的蝶啶类成分，所得的无关杂质多，影响指纹图谱的全面性和精确性；仅以次黄嘌呤作为参照物，而对水蛭中其它重要药效及质量标志性成分，如尿嘧啶、黄嘌呤、尿苷、水蛭胺C、水蛭胺B、水蛭胺A等均没有涉及，不能准确、全面地反映水蛭药材的质量；梯度洗脱过程中，在流动相不含有机相的时间段，普通C₁₈色谱柱填料中的C₁₈链的随机卷曲将导致组分保留值变化，造成色谱系统不稳定。袁晓环等以HPLC指纹图谱来控制水蛭注射液及复方水蛭注射液的质量，并建立了水蛭注射液的指纹图谱，但两篇文献水蛭指纹图谱建立方法的局限性与中国专利CN1844911A相同，其注射液或复方注射液仅以次黄嘌呤作为参照物，而对水蛭中其它重要药效成分及质量标志性成分，如尿嘧啶、黄嘌呤、尿苷、水蛭胺C、水蛭胺B、水蛭胺A等均没有涉及，不能准确、全面地反映水蛭注射液或复方水蛭注射液的质量；且梯度洗脱过程中，在流动相不含有机相的时间段，普通C₁₈填料中的C₁₈链的随机卷曲将导致组分保留值变化，造成色谱系统不稳定（杨晓环，杨旭东，崔荣军，等.水蛭注射液的HPLC指纹图谱[J].中国医药工业杂志，2008，39（7）：530～532.）、（杨晓环，杨旭东，王春涛，等.复方水蛭注射液HPLC指纹图谱研究[J].中国中药杂志，2008，33（15）：1825～1827.）。徐长根等对水蛭冻干粉针剂指纹图谱的建立方法进行了研究，并得到了其指纹图谱，但其仅以次黄嘌呤溶液作为参照物，不能全面、准确反映水蛭冻干粉针剂中其它重要水蛭药效成分的质量；梯度洗脱过程中，在流动相含极小比例（小于0.15%）有机相的时间段，普通C₁₈填料中的C₁₈链的随机卷曲将导致组分保留值变化，造成色谱系统不稳定；并且其指纹图谱上的特征峰太少，且分离不佳（徐长根，罗世书，谢艳华.水蛭冻干粉针剂指纹图谱评价[J].第四军医大学学报，2009，30（22）：2667～2669.）。