[发明专利]水蛭指纹图谱的建立方法及其标准指纹图谱

权利要求书

1.水蛭指纹图谱的建立方法，其特征在于将水蛭制备成供试品溶液，经过高效液相色谱仪分离检测，获得水蛭的指纹图谱；

所述方法包括如下步骤：

1）供试品溶液的制备：取水蛭粗粉，以甲醇溶液回流提取，离心，取上清液加在碱性氧化铝层析柱上，收集过柱液，再以水洗脱，合并过柱液及水洗脱液，过滤，作为供试品溶液；

2）参照物溶液的制备：取尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、尿苷、水蛭胺C、水蛭胺B、水蛭胺A对照品，溶于甲醇溶液作为参照物溶液；

3）制作水蛭指纹图谱：分别精密吸取供试品溶液和参照物溶液，经高效液相色谱仪分离检测，其中，流动相的组成为10mmol/L的磷酸二氢钾溶液—乙腈；采用梯度洗脱；得到水蛭指纹图谱。

2.如权利要求1所述的水蛭指纹图谱的建立方法，其特征在于所述供试品溶液按如下步骤制备：精密称取水蛭粗粉5g，置具塞容器中，精密加入50%甲醇溶液50ml，水浴回流提取30min，以10000rpm的速度高速离心10min，精密量取上清液20ml，加在碱性氧化铝柱（氧化铝为6g，100～200目，层析柱内径为1.5cm）上，收集过柱液，再用水30ml洗脱，合并过柱液及水洗脱液，置50ml容量瓶中，加水至刻度，摇匀，经0.45μm微孔滤膜过滤，作为供试品溶液。

3.如权利要求1所述的水蛭指纹图谱的建立方法，其特征在于所述的高效液相色谱仪分离检测条件为：色谱柱为YMC-Pack-ODS-AQ C₁₈柱（250x4.6mm，5μm）；流动相为10mmol/L的磷酸二氢钾溶液—乙腈；采用梯度洗脱：0min→15min→40min→60min，乙腈0%→0%→20%→20%；流速0.8ml/min；检测波长254nm；进样量10μl；柱温30℃。

4.如权利要求1所述的水蛭指纹图谱的建立方法，其特征在于所述参照物溶液按如下步骤制备：取尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、尿苷、水蛭胺C、水蛭胺B、水蛭胺A对照品适量，精密称定，加50%甲醇溶解并稀释成每1ml中含尿嘧啶30μg、次黄嘌呤80μg、黄嘌呤20μg、尿苷20μg、水蛭胺C30μg、水蛭胺B30μg和水蛭胺A30μg的混合溶液，摇匀。

5.由权利要求1至4中任一项所述的水蛭指纹图谱的建立方法得到的水蛭标准指纹图谱，其特征在于：有13个特征峰，第3、5、6、7、9、10、12号色谱峰分别依次对应尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、尿苷、水蛭胺C、水蛭胺B和水蛭胺A，其中5号次黄嘌呤峰最强，图谱总长度为60min，平均保留时间t如下：

1号峰，平均保留时间t为4.6min；

2号峰，平均保留时间t为7.3min；

3号峰，平均保留时间t为8.4min；

4号峰，平均保留时间t为10.3min；

5号峰，平均保留时间t为14.9min；

6号峰，平均保留时间t为18.0min；

7号峰，平均保留时间t为20.2min；

8号峰，平均保留时间t为26.8min；

9号峰，平均保留时间t为30.7min；

10号峰，平均保留时间t为33.2min；

11号峰，平均保留时间t为35.4min；

12号峰，平均保留时间t为37.1min；

13号峰，平均保留时间t为40.9min。