[发明专利]AFP和IL-2双基因共表达重组载体及其制备方法和应用

权利要求书

1.AFP和IL-2双基因共表达重组载体，其沿载体转录方向依次连接有AFP基因、IRES序列和IL-2基因，或者沿载体转录方向依次连接有IL-2基因、IRES序列和AFP基因；

所述AFP基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:1所示，所述IL-2基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:2所示，所述IRES序列的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:3所示。

2.根据权利要求1所述的AFP和IL-2双基因共表达重组载体，其特征在于：所述的载体为pIRES2-EGFP质粒载体，所述的双基因共表达重组载体为pIRES2-AFP-IL-2重组载体；其中，AFP基因位于IRES序列的上游，IL-2基因位于IRES序列的下游。

3.根据权利要求2所述的AFP和IL-2双基因共表达重组载体，其特征在于：所述pIRES2-EGFP质粒载体中的EGFP序列被IL-2基因替代。

4.权利要求1所述的AFP和IL-2双基因共表达重组载体的制备方法，包括以下步骤：

1）获得含有特异性酶切位点的AFP基因片段；

2）将步骤1）得到的AFP基因片段连接于载体，构建含有AFP基因的重组载体；

3）获得含有酶切粘性末端的IL-2基因片段；

4）将步骤3）得到的IL-2基因片段连接于步骤2）得到的重组载体，构建所述的AFP和IL-2双基因共表达重组载体。

5.权利要求2所述的AFP和IL-2双基因共表达重组载体的制备方法，包括以下步骤：

a）获得含有特异性酶切位点的AFP基因片段：从肝癌细胞HepG2获取cDNA作为模板，用含有Bgl II和EcoR I酶切位点序列的AFP特异性引物进行PCR扩增，得到含有Bgl II和EcoR I酶切位点的AFP基因片段，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:6所示；

b）构建pIRES2-AFP-EGFP重组载体：用限制性内切酶Bgl II、EcoR I分别酶切pIRES2-EGFP质粒以及步骤a）得到的AFP基因片段，并采用T4DNA连接酶进行连接反应，得到pIRES2-AFP-EGFP重组载体；

c）获得含有酶切粘性末端的IL-2基因片段：从CIK细胞获取cDNA作为模板，用含有BstX I和Not I酶切粘性末端的IL-2特异性引物进行PCR扩增，所得到的PCR反应产物再进行杂交PCR反应，得到IL-2基因片段混合物，其中的一种IL-2基因片段具有BstX I和Not I酶切粘性末端；

d）构建pIRES2-AFP-IL-2重组载体：用限制性内切酶BstX I、Not I酶切步骤b）得到的pIRES2-AFP-EGFP重组载体，将步骤c）得到的IL-2基因片段混合物与酶切后线性化的pIRES2-AFP-EGFP重组载体混合，采用T4DNA连接酶进行连接反应，得到pIRES2-AFP-IL-2重组载体。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤a）所述的AFP特异性引物为：

AFP上游引物：5’-GCAGATCTATGAAGTGGGTGGAA-3’，

AFP下游引物：5’-TTGAATTCTTAAACTCCCAAAGCAGC-3’。

7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤c）所述的IL-2特异性引物包括IL-2第一引物对和IL-2第二引物对，所述的IL-2第一引物对由IL-2上游长引物和IL-2下游长引物组成，所述的IL-2第二引物对由IL-2上游短引物和IL-2下游短引物组成：

IL-2第一引物对为：

IL-2上游长引物：5'-AACCATGTACAGGATGCAACTCCTGTCTT-3'，

IL-2下游长引物：5'-GGCCGCTCAAGTCAGTGTTGAGATGAT-3'；

IL-2第二引物对为：

IL-2上游短引物：5'-ATGTACAGGATGCAACTCCTGTCTT-3'，

IL-2下游短引物：5'-GCTCAAGTCAGTGTTGAGATGATGC-3'。

8.权利要求1或2所述的AFP和IL-2双基因共表达重组载体在肝癌基因免疫治疗中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：将所述的AFP和IL-2双基因共表达重组载体转染肝癌患者自身或异体分离的树突状细胞后植入患者体内，进行肝癌基因免疫治疗。