[发明专利]具有延长的体内半衰期的因子VIII，冯·维勒布兰德因子或它们的复合物

说明书

本申请是申请日为2009年6月24日、申请号为200980123818.X、发明名称为“具有延长的体内半衰期的因子VIII、冯·维勒布兰德因子或它们的复合物”的中国发明专利申请的分案申请。 

【技术领域】

本发明涉及编码凝血因子VIII（FVIII）及冯·维勒布兰德因子（VWF）以及它们的复合物及它们的衍生物的修饰的核酸序列，含该核酸序列的重组表达载体，用该重组表达载体转化的宿主细胞，所述核酸序列编码的重组多肽及衍生物，所述重组多肽及衍生物具有生物活性，及相比未修饰的野生型蛋白具有延长的体内半衰期和/或提高的体内恢复。本发明还涉及导致提高的表达产率的相应FVIII序列。本发明还涉及制备该重组蛋白及它们的衍生物的方法。本发明还涉及用于人基因治疗的转移载体，其包括该修饰的核酸序列。 

【背景技术】

有各种出血障碍凝血因子缺陷引发。最常见的障碍是血友病A及B，分别由凝血因子VIII及IX缺陷所致。另一已知的出血障碍是冯·维勒布兰德病。 

在血浆中，FVIII大多以与VWF的非共价复合物形式存在，及其促凝剂功能加速因子X到Xa的因子IXa依赖的转变。由于FVIII与VWF的复合物形成，长时间认为，FVIII与VWF功能是同一分子的2个功能。到了七十年代才得知FVIII与VWF是在生理条件下形成复合物的独立的分子。到了八十年代测定出约0.2nmol/L的解离常数(Leyte et al.,Biochem J1989,257:679-683)，及研究了2种分子的DNA序列。 

经典的血友病或血友病A是遗传的出血障碍。其由凝血因子FVIII的染色体X-联锁的缺陷所致，及以每10,000个人介于1个和2个个体之间的发病率几乎仅影响男性。X-染色体缺陷可被本身不是血友病患者的女性携带者传递。血友病A的临床表现是增加的出血趋势。 用FVIII浓缩物治疗之前，患严重的血友病的人的平均寿命少于20年。自血浆的FVIII浓缩物的使用显著改善了血友病A患者的状况，大大增加了平均寿命，假设他们中的大部分活大致正常寿命的可能性。但是，已有某些有关源于血浆的浓缩物及它们的使用的问题，其中最严重的问题是病毒传播。迄今，导致乙型肝炎，非甲非乙型肝炎及AIDS的病毒已经严重危害人群。从此以后，已新开发了不同的病毒灭活方法及新的高度纯化的FVIII浓缩物，它们也对于血浆来源的FVIII建立了非常高的安全标准。 

FVIII的cDNA的克隆（Wood et al.1984.Nature312:330-336;Vehar et al.1984.Nature312:337-342）使重组表达FVIII成为可能，导致开发了几种重组FVIII产物，它们已在1992和2003之间被有关机关批准。位于氨基酸Arg-740和Glu-1649之间的FVIII多肽链的中央B结构域对于全生物活性似乎不是必需的事实也导致开发了删除了B结构域的FVIII。 

成熟的FVIII分子由2332个氨基酸构成，其可分为3个同源A结构域，2个同源C结构域及1个B结构域，它们以下列顺序排列：A1-A2-B-A3-C1-C2。成熟的人FVIII的完整氨基酸序列示于SEQ ID NO：15。在其分泌到血浆的过程中，FVIII被细胞内加工为一系列金属-离子连接的异源二聚体作为单链FVIII，其在B-A3边界及在B-结构域内的不同位点被切割。此加工产生由A1，A2及B-结构域的不同部分构成的异源重链分子，其具有90kD～200kDa的分子大小。此重链经金属离子结合到轻链，所述轻链由A3，C1及C2结构域构成（Saenko et al.2002.Vox Sang.83:89-96）。在血浆中，此异源二聚体FVIII以高亲和性结合冯·维勒布兰德因子（VWF），其保护其免于成熟前分解代谢。在血浆中非活化的FVIII结合VWF的半衰期为约12小时。