[发明专利]一种维生素C第二步发酵法中耐酸性小菌的选育方法

说明书

技术领域

本发明属于微生物工程技术领域，具体涉及一种维生素C第二步发酵法中耐酸性小菌的选育方法。

背景技术

目前，维生素C第二步发酵是将L-山梨糖氧化生成2-酮基-L-古龙酸，由一组大、小混合菌配合进行，其中氧化葡萄糖杆菌（俗称小菌）是产酸菌，直接负责山梨糖生物氧化；另一种微生物俗称大菌，包括巨大芽孢杆、蜡状芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌等，作为伴生菌起到辅助古龙酸杆菌生长和产酸的作用，待2-酮基-L-古龙酸生成后，再经内酯化和烯醇化生成维生素C。

在上述混菌发酵中，两种菌的生物学特性不同，它们间既有共生又有拮抗作用，且因环境因子的影响而导致培养过程中混合菌菌群状态的多样化。混合菌菌群状态不同，其发酵过程中菌群活力及生理行为即不同，其积累2-酮基-L-古龙酸（2-KLG）的能力亦有所差别。在现有摇瓶发酵工艺中，中后期靠基础料中磷酸二氢钾、碳酸钙的缓冲作用和尿素来维持适宜的pH范围；在现有大生产发酵工艺中，通过流加浓度为25%的碳酸钠溶液来控制适宜的pH范围，且大量生产结果表明，在12～48h内，2-KLG的形成速率与碱液流加的速率呈线性关系。碳酸钠溶液属于强碱弱酸盐，如若补料控制不得当，会造成培养液局部过碱从而破坏2-KLG的形成；同时也会因生产工序的繁琐而带来用工成本、原材料成本的增加。

发明内容

本发明的目的就在于克服上述现有技术的缺陷，提供一种不用碱性物质调pH的条件下也能正常生长的维生素C第二步发酵法中耐酸性小菌的选育方法。

本发明所采取的技术方案为：

一种维生素C第二步发酵法中耐酸性小菌的选育方法，其特征是：将生产用大小菌混合菌经过三代钟液活化培养后涂布平板培养基进行分离培养，挑取饱满、光滑、边缘整齐的单个小菌在平板培养基上划线增殖培养，之后选取生长厚实、无杂菌污染的小菌接种入斜面培养基内增殖培养，再将大菌接入该斜面培养基中与小菌一起混合培养，培养结束后依次将斜面混合菌种接入种瓶，经二代种液活化培养后进行发酵培养，检测发酵液中古龙酸含量及残糖，在酸性环境下能稳定产酸，且筛选株产古龙酸比对照株产古龙酸含量提高在5%以上的耐酸性菌株，留种保藏。

所述种液活化培养条件为在28～32℃温度条件下培养20～24h，其所用种液培养基重量体积比为：山梨糖1.5%、玉米浆0.3%、尿素0.4%、磷酸二氢钾0.05%、硫酸镁0.02%、碳酸钙0.4%。

所述分离培养是将混合大小菌3代种子液稀释至10-7～10-8，涂布于平板上，28～32℃培养3～4天。

所述划线增殖培养是在经28～32℃下培养3～4天。

所述分离培养和划线增殖培养培养所用平板培养基重量体积比为：L-山梨糖1.0%、酵母膏0.5%、玉米浆0.5%、尿素0.3%、磷酸二氢钾0.05%、硫酸镁0.03%、碳酸钙0.5%、琼脂粉1.8～2.0%。

所述小菌的增值培养条件为在28～32℃培养18～20hr。

所述大小菌混合培养是在28～32℃培养2～3天。

所述小菌的增值培养和大小菌的混合培养所用斜面培养基重量体积比为：山梨糖1.0%、酵母膏0.5%、玉米浆0.5%、尿素0.3%、磷酸二氢钾0.05%、硫酸镁0.03%、碳酸钙0.5%、琼脂粉1.8～2.0%。

所述发酵培养条件为在28～32℃、200r/min下震荡培养3～4天，其所用培养基重量体积比为：山梨糖10%、酵母膏0.01%、玉米浆1.5%、尿素0.1%、磷酸二氢钾0.05%、硫酸镁0.01%、碳酸钙0.5%。

所述经过三代种液活化培养的种子液，检测2-酮基-L-古龙酸大于5mg/ml时，才能用于分离培养。

通过本发明的方法，可选育出在酸性环境下能正常、稳定产酸，且生长周期短、糖酸转化率高的耐酸性小菌，将该耐酸性小菌用于维生素C第二步发酵，可使产酸量平均提高5%，糖酸转化率平均提高4%，且在发酵工段，不需再用25%碳酸钠去调发酵过程中的料液pH，节省了原材料，可使生产成本降低1.8%，工艺也获得了简化。

具体实施方式

按下述流程进行选育：

挑选优良生产株→接种种液活化1代→接种种液活化2代→接种种液活化3代→分离涂平板→平板增殖→斜面划线接种→接种种液活化1代→接种种液活化2代→接种发酵→摇瓶考察→筛选留种。

实施例：

1、配制种子培养基重量体积比：

山梨糖1.5%、玉米浆0.3%、尿素0.4%、磷酸二氢钾0.05%、硫酸镁0.02%、碳酸钙0.4%，经121℃灭菌30min。