[发明专利]一种维生素C第二步发酵法中耐酸性小菌的选育方法

权利要求书

1.一种维生素C第二步发酵法中耐酸性小菌的选育方法，其特征是：将生产用大小菌混合菌经过三代钟液活化培养后涂布平板培养基进行分离培养，挑取饱满、光滑、边缘整齐的单个小菌在平板培养基上划线增殖培养，之后选取生长厚实、无杂菌污染的小菌接种入斜面培养基内增殖培养，再将大菌接入该斜面培养基中与小菌一起混合培养，培养结束后依次将斜面混合菌种接入种瓶，经二代种液活化培养后进行发酵培养，检测发酵液中古龙酸含量及残糖，在酸性环境下能稳定产酸，且筛选株产古龙酸比对照株产古龙酸含量提高在5%以上的耐酸性菌株，留种保藏。

2.按照权利要求1所述的维生素C第二步发酵法中耐酸性小菌的选育方法，其特征在于所述种液活化培养条件为在28～32℃温度条件下培养20～24h，其所用种液培养基重量体积比为：山梨糖1.5%、玉米浆0.3%、尿素0.4%、磷酸二氢钾0.05%、硫酸镁0.02%、碳酸钙0.4%。

3.按照权利要求1所述的维生素C第二步发酵法中耐酸性小菌的选育方法，其特征在于所述分离培养是将混合大小菌3代种子液稀释至10^-7～10^-8 ，涂布于平板上，28～32℃培养3～4天。

4.按照权利要求1所述的维生素C第二步发酵法中耐酸性小菌的选育方法，其特征在于所述划线增殖培养是在经28～32℃下培养3～4天。

5.按照权利要求1或3或4所述的维生素C第二步发酵法中耐酸性小菌的选育方法，其特征在于所述分离培养和划线增殖培养培养所用平板培养基重量体积比为：L-山梨糖1.0%、酵母膏0.5%、玉米浆0.5%、尿素0.3%、磷酸二氢钾0.05%、硫酸镁0.03%、碳酸钙0.5%、琼脂粉1.8～2.0%。

6.按照权利要求1所述的维生素C第二步发酵法中耐酸性小菌的选育方法，其特征在于所述小菌的增值培养条件为在28～32℃培养18～20hr。

7.按照权利要求1所述的维生素C第二步发酵法中耐酸性小菌的选育方法，其特征在于所述大小菌混合培养是在28～32℃培养2～3天。

8.按照权利要求1或6或7所述的维生素C第二步发酵法中耐酸性小菌的选育方法，其特征在于所述小菌的增值培养和大小菌的混合培养所用斜面培养基重量体积比为：山梨糖1.0%、酵母膏0.5%、玉米浆0.5%、尿素0.3%、磷酸二氢钾0.05%、硫酸镁0.03%、碳酸钙0.5%、琼脂粉1.8～2.0%。

9.按照权利要求1所述的维生素C第二步发酵法中耐酸性小菌的选育方法，其特征在于所述发酵培养条件为在28～32℃、200r/min下震荡培养3～4天，其所用培养基重量体积比为：山梨糖10%、酵母膏0.01%、玉米浆1.5%、尿素0.1%、磷酸二氢钾0.05%、硫酸镁0.01%、碳酸钙0.5%。

10.按照权利要求1所述的维生素C第二步发酵法中耐酸性小菌的选育方法，其特征在于所述经过三代种液活化培养的种子液，检测2-酮基-L-古龙酸大于５mg/ml时，才能用于分离培养。