[发明专利]一种医疗检测用高纯度甲状旁腺激素的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及的是一种医疗检测用高纯度甲状旁腺激素的制备方法,属于基因工程技术及化学化工技术领域。

背景技术

甲状旁腺激素(PTH)是由甲状旁腺主细胞分泌的由84个氨基酸组成的碱性单链多肽类激素。在分泌过程中115个氨基酸的前甲状旁腺素原切除N端的31个氨基酸变成成熟的hPTH1-84。PTH在血液中的半衰期仅数分钟，在体内可降解成N端(1-34)肽等活性片段。

PTH是人体内重要的钙磷调节因子，靶器官是骨和肾脏，其主要功能是调节脊椎动物体内肾脏对钙的重吸收和磷酸盐的排泄，使血钙浓度升高，血磷浓度降低，对于骨的重建尤为重要。正常人血浆中PTH的浓度约为1纳克/毫升，临床上将PTH作为检测肾功能、甲状旁腺及关节病变的生理指标。高纯度的PTH可作为标准物质，用于快速准确的检测病人血浆中PTH含量和疾病的诊断；并可进一步进行稳定同位素标记，作为质谱方法检测甲状旁腺激素的内标物。

本项目通过基因工程技术构建高效表达hPTH1-84的大肠杆菌，经过15%SDS-PAGE凝胶电泳鉴定，目的蛋白的表达量占总蛋白的40%-50%左右，适当的破菌方法能使目的蛋白几乎全部存在于上清中。离心分离后得到的上清经过适当的酸处理技术不但能去除将近30%的杂蛋白同时还能让PTH1-84带上正电荷，有利于后续过Q柱的分离纯化，分离纯化后的PTH1-84经过106稀释后测得的含量为6.2pg/ml。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术存在的不足，而提供一种从基因重组的大肠杆菌中提取医疗检测用高纯度甲状旁腺激素的制备方法。

本发明的要点是首先利用基因工程技术构建能高效生产PTH1-84的大肠杆菌，再用强的阴离子柱提取高纯度的PTH1-84；具体包括以下的工艺步骤：

A)利用基因工程技术构建含有PTH1-84基因序列的质粒载体，将该载体转化到大肠杆菌感受态中；

B）挑取单菌落加入到LB培养基中扩大培养，加入氨苄青霉素，使终浓度达到45-55ug/ml；35-40℃，200-250rpm培养至OD₆₀₀=0.4-0.8后加入IPTG诱导，诱导5-9小时后，离心收集菌体，8000-9000rpm，12-18min，-70—-90℃冰箱冷冻；

C)菌体沉淀用20mM pH5.7的PB缓冲液重悬，重悬的菌液置冰上超声破碎；

D）破碎好的菌液10000-15000rpm，3-5℃，离心0.8-1.2h，收集上清，上清用已经稀释过的甲酸进行酸处理后，10000-15000rpm，3-5℃，离心0.8-1.2h；收集好的上清用0.22um的微孔膜过滤一次，准备过强阴离子柱；

E)Buffer A为20mM pH4.8的PB缓冲液，Buffer B由Buffer A加入1M/L的NaCl组成，洗脱时Buffer B的浓度范围为0-100%，洗脱流速为0.8-1.2ml/min，洗脱时间4-8h，收集具有活性的高盐洗脱峰。

本发明优选的技术方案是：

步骤A)中，利用基因工程技术构建含有PTH1-84基因序列的质粒载体，将该载体转化到BL21DE3细胞感受态中；

步骤B）中，将感受态细胞均匀涂布到含氨苄青霉素的LB固体平板上，37℃培养箱，培养过夜；

挑取LB平板上的单菌落加入到5ml的LB培养基中，加入氨苄青霉素使终浓度达到50ug/ml，培养过夜；

将过夜培养的BL21DE3菌液转移到1L的培养基中，加入氨苄青霉素，使终浓度达到50ug/ml；37℃，220rpm培养至OD₆₀₀=0.6后加入IPTG诱导，IPTG终浓度为1mM/L；继续37℃，220rpm培养7小时后，8500rpm，离心15分钟得菌体沉淀，去离子水重悬离心后，-80℃冰箱冷冻；

步骤C）中，菌体沉淀用50ml，20mM pH5.7的PB缓冲液重悬，重悬的菌液置冰上超声破碎，功率350W，工作时间2S，间隔5S，总工作时间90min；

步骤D）中，破碎好的菌液12000rpm，4℃，离心1h，收集上清，上清用已经稀释过的甲酸进行酸处理至pH4.8；12000rpm，4℃，离心1h；收集好的上清用0.22um的微孔膜过滤一次，准备过柱；