[发明专利]一种医疗检测用高纯度甲状旁腺激素的制备方法

权利要求书

1.一种医疗检测用高纯度甲状旁腺激素的制备方法,其特征在于该制备方法包括以下步骤:

A)利用基因工程技术构建含有PTH1-84基因序列的质粒载体，将该载体转化到大肠杆菌感受态中；

B）挑取单菌落加入到LB培养基中扩大培养，加入氨苄青霉素，使终浓度达到45-55ug/ml；35-40℃，200-250rpm培养至OD₆₀₀=0.4-0.8后加入IPTG诱导，诱导5-9小时后，离心收集菌体，8000-9000rpm，12-18min，-70—-90℃冰箱冷冻；

C)菌体沉淀用20mM pH5.7的PB缓冲液重悬，重悬的菌液置冰上超声破碎；

D）破碎好的菌液10000-15000rpm，3-5℃，离心0.8-1.2h，收集上清，上清用已经稀释过的甲酸进行酸处理后，10000-15000rpm，3-5℃，离心0.8-1.2h；收集好的上清用0.22um的微孔膜过滤一次，准备过强阴离子柱；

E)Buffer A为20mM pH4.8的PB缓冲液，Buffer B由Buffer A加入1M/L的NaCl组成，洗脱时Buffer B的浓度范围为0-100%，洗脱流速为0.8-1.2ml/min，洗脱时间4-8h，收集具有活性的高盐洗脱峰。

2.根据权利要求1所述的医疗检测用高纯度甲状旁腺激素的制备方法,其特征在于所述的步骤中：

步骤A)中，利用基因工程技术构建含有PTH1-84基因序列的质粒载体，将该载体转化到BL21DE3细胞感受态中；

步骤B）中，将感受态细胞均匀涂布到含氨苄青霉素的LB固体平板上，37℃培养箱，培养过夜；

挑取LB平板上的单菌落加入到5ml的LB培养基中，加入氨苄青霉素使终浓度达到50ug/ml，培养过夜；

将过夜培养的BL21DE3菌液转移到1L的培养基中，加入氨苄青霉素，使终浓度达到50ug/ml；37℃，220rpm培养至OD₆₀₀=0.6后加入IPTG诱导，IPTG终浓度为1mM/L；继续37℃，220rpm培养7小时后，8500rpm，离心15分钟得菌体沉淀，去离子水重悬离心后，-80℃冰箱冷冻；

步骤C）中，菌体沉淀用50ml，20mM pH5.7的PB缓冲液重悬，重悬的菌液置冰上超声破碎，功率350W，工作时间2S，间隔5S，总工作时间90min；

步骤D）中，破碎好的菌液12000rpm，4℃，离心1h，收集上清，上清用已经稀释过的甲酸进行酸处理至pH4.8；12000rpm，4℃，离心1h；收集好的上清用0.22um的微孔膜过滤一次，准备过柱；

步骤E）中，Buffer A为20mM pH4.8的PB缓冲液，Buffer B为Buffer A+1M/L的NaCl；Q柱用Buffer A平衡两个柱体积后开始上样，上样流速为1ml/min,上样量为柱体积的20%，完成上样后用Buffer A继续淋洗两个柱体积，然后开始梯度洗脱，洗脱时BufferB的浓度范围为0-100%，洗脱流速为1ml/min，洗脱时间为6h；分部收集各高盐洗脱下来的洗脱峰，免疫活性检测后，收集活性最高的部分。