[发明专利]一种土壤样品中微生物总DNA的提取方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种土壤样品中微生物总DNA的提取方法，更具体地，本发明为油气田土壤样品中微生物总DNA的提取方法。

背景技术

传统的油气微生物勘探技术是利用微生物计数、富集培养、分离以及微生物代谢产物的生理、生化分析来研究土壤中油气微生物的异常，从而预测油气藏的存在。但是近年来，国内外许多研究者已经逐渐认识到常规的微生物分离培养技术在微生物计数测定时具有很大的局限性，具体表现为可分离出的微生物种类只占土壤微生物种类总数的0.1%-1%，许多“存活但不能培养”的微生物不能被分离和鉴定。因此传统培养法有可能使土壤微生物在土壤生态系统中的生活特征和生态功能的信息被忽视。其次，传统微生物的培养计数方法（如MPN法和平板计数）还具有耗时费力、不能及时反映菌体生长情况、不能区分细胞死活、受培养基成分和代谢产物性质影响等缺点。MPN法需要做梯度稀释，一般需要5-7个稀释度，而且要重复3-5管，而且还要2-3个平行，因此工作量巨大，给规模化操作和快速检测造成了困难。MPN法检测油气指示微生物还面临观察微生物生长比较困难的难题。油气指示微生物需要通气培养，微生物生长非常缓慢而且表现不明显，需要添加指示剂进行观察其生长状况，结果容易造成误判。因此，利用传统的微生物培养来检测油气微生物还存在很大的不足。分子生物学的快速发展为油气微生物的检测提供了新的契机，其优点首先在于该方法不依赖于培养技术，可以避免油气指示微生物生长周期长，难于培养和检测的缺点。其次，具有快速、灵敏的特点，特别适合样品中数量较少的油气指示菌的情况，可以快速检测特定基因得到结果。

作为分子生物学检测方法的基础，最重要的一步就是从土壤样品中尽量毫无偏差地提取出高质量的微生物总基因组DNA。土壤样品成分复杂，含大量有机和无机化合物，并且微生物细胞通常紧紧吸附于颗粒表面。另外，土壤样品中通常含有大量影响DNA后续分子操作(如限制性内切酶酶切、转化、PCR扩增等)的物质，例如腐植酸、重金属离子等，且各种土壤类型组成不一，这些都为从土壤中有效提取高质量的DNA带来了困难。特别的，用于微生物油气勘探的土壤样品，为避免地表环境的干扰，大多采样深度较深，相对于表层土壤，微生物种类和数量明显偏少。另外，勘探过程中会遇到大量的粘土样品，而粘土样品的DNA提取恰恰是目前国内外急需解决的难题。

CN101230342A公开一种提高DNA质量的土壤样品总DNA提取方法，在该方法中，先使用酶法和化学法对细胞进行破碎，然后对其进行冻融处理，该方法对微生物细胞壁破碎效率不高。US5824224A公开了一种快速提取DNA的装置及利用该装置快速提取DNA的方法；但其中采用常规的DNA提取方法和试剂，其提取效果一般。

鉴于此，很有必要开发一种能够高效提取油气勘探土壤样品DNA的方法，以提高微生物油气勘探的准确性和可靠性。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种能够高效提取油气勘探土壤样品中总DNA的方法。本发明依次采取物理法、酶法和化学法三种裂解方法结合进行细胞破碎，针对各种不同类型的油气勘探土壤样品都能够稳定高效地提取得到DNA，从而保证后续分子生物学检测的灵敏度和准确性，以满足科研和生产的需要。

因此，本发明提供一种土壤样品中微生物总DNA的提取方法，包括：步骤A，在土壤样品中加入DNA提取缓冲液后，对土壤样品中的微生物进行物理法细胞破碎；步骤B，然后使用蛋白酶K溶液对步骤A得到的土壤样品中的微生物进行酶法细胞破碎；步骤C，再对步骤B得到的土壤样品中的微生物进行化学法细胞破碎后，将所得溶液离心并收集上清液；步骤D，用有机溶剂对所述上清液进行抽提后离心并收集上清液；在所述上清液中加入沉淀剂进行沉淀，离心并收集沉淀；然后将所述沉淀洗涤并干燥和溶解后，得到DNA粗提液；步骤E，将所述DNA粗提液采用吸附柱纯化后得到纯化的DNA提取液。

本发明中，步骤E中的所述纯化的DNA提取液可直接用于后续分子生物学检测，或分装并保存于-20℃待用。

在本发明中，优选地，步骤A中所述物理法细胞破碎为对其冻融2～5次；步骤B中酶法细胞破碎的水浴温度为30～45℃；步骤C中所述化学法细胞破碎为使用表面活性剂进行细胞破碎；优选步骤B中加入蛋白酶K溶液的水浴时间为5min～3h。更优选所述表面活性剂为十二烷基磺酸钠溶液，且化学破碎的温度为60～70℃，水浴时间为5min～3h。