[发明专利]重编程培养基、其制备方法及重编程细胞的培养方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物医学技术领域，具体而言，涉及一种重编程培养基、其制备方法及重编程细胞的培养方法。

背景技术

日本学者中山申弥(Shinya Yamanaka)于2006年和2007年，首次通过导入四个转录因子(Oct4,Sox2,Klf4和c-Myc）的方法，分别成功将小鼠(Takahashi and Yamanaka.,2006)和人(Takahashi et al.,2007)的皮肤成纤维细胞重编程为诱导多能干细胞（Induced Pluripotent Stem Cells,iPSCs），并因此获得了2012年的诺贝尔医学和生理学奖。hiPS细胞（诱导多能干细胞）具备hES细胞（人胚胎干细胞）的所有分化能力，并且没有伦理问题，在不久的将来会完全取代hES细胞，成为再生医学的最主要细胞来源。

目前，世界范围内绝大部分科研人员使用人体细胞的重编程培养条件，都需要明胶包被和饲养层细胞（小鼠胚胎成纤维细胞，mouse embryonic fibroblasts,MEF）的支持。此外，还采用成分复杂的敲除血清替代品（Knockout Serum Replacement,KOSR）作为主要的培养基添加剂。这样产生的hiPS细胞，因为长期暴露在富含动物制品的培养环境中，在移植后容易产生人体排斥反应，不能作为合适的细胞来源。同时，由于血清替代品不同批次差异较大，所以很不稳定，容易影响实验进度和结果，造成损失。另外，还由于用于重编程的培养基还需要MEF做饲养层，不同批次MEF的质量差异较大，严重影响重编程效率。

发明内容

本发明旨在提供一种重编程培养基、其制备方法及重编程细胞的培养方法，以解决现有技术中hiPS细胞因为长期暴露在富含动物制品的培养环境中，在移植后容易产生人体排斥反应及现有技术中的重编程培养基严重影响细胞重编程效率的技术问题。

为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种重编程培养基。该重编程培养基包括基础培养基，重编程添加剂1及重编程添加剂2；其中，基础培养基为DMEM/F12培养基；重编程添加剂1包括碳酸氢钠400～600ug/ml、硒酸钠8～20ng/ml、重组人胰岛素15～30ug/ml、重组人碱性成纤维细胞生长因子80～120ng/ml、重组人转铁蛋白7～13ug/ml、抗坏血酸50～70ug/ml以及氢化可的松0.5～2uM；重编程添加剂2包括碳酸氢钠400～600ug/ml，硒酸钠8～20ng/ml，重组人胰岛素15～30ug/ml，重组人碱性成纤维细胞生长因子80～120ng/ml，重组人转铁蛋白7～13ug/ml，抗坏血酸50～70ug/ml，丙戊酸0.5～2mM以及丁酸钠80～200uM。

进一步地，重编程添加剂1包括碳酸氢钠520～580ug/ml、硒酸钠12～16ng/ml、重组人胰岛素18～22ug/ml、重组人碱性成纤维细胞生长因子90～110ng/ml、重组人转铁蛋白10～12ug/ml、抗坏血酸63～66ug/ml以及氢化可的松0.9～1.1uM；重编程添加剂2包括碳酸氢钠520～580ug/ml、硒酸钠12～16ng/ml、重组人胰岛素18～22ug/ml、重组人碱性成纤维细胞生长因子90～110ng/ml、重组人转铁蛋白10～12ug/ml、抗坏血酸63～66ug/ml以及丙戊酸0.9～1.2mM以及丁酸钠140～160uM。

进一步地，重编程添加剂1包括碳酸氢钠543ug/ml、硒酸钠14ng/ml、重组人胰岛素20ug/ml、重组人碱性成纤维细胞生长因子100ng/ml、重组人转铁蛋白11ug/ml、抗坏血酸65ug/ml以及氢化可的松1uM；重编程添加剂2包括碳酸钠543ug/ml、硒酸钠14ng/ml、重组人胰岛素20ug/ml、重组人碱性成纤维细胞生长因子100ng/ml、重组人转铁蛋白11ug/ml、抗坏血酸65ug/ml以及丙戊酸1mM以及丁酸钠150uM。

进一步地，基础培养基保存在4～8℃，重编程添加剂1及重编程添加剂2保存在-20～-80℃单独冰冻保存。

进一步地，重编程培养基在使用前配制成重编程培养基1和重编程培养基2，具体包括以下步骤：在2～8℃化冻重编程添加剂1及重编程添加剂2；将重编程添加剂1与基础培养基以7:500的体积配混合后形成重编程培养基1；将重编程添加剂2与基础培养基以7:500的体积配混合后形成重编程培养基2。

进一步地，重编程培养基1和重编程培养基2在使用前0～14天配制，并在2～8℃保存。