[发明专利]毕赤酵母全细胞脂肪酶催化制备生物柴油的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物工程与能源技术领域，涉及一种生物柴油的制备方法，尤其是一种毕赤酵母全细胞脂肪酶催化制备生物柴油的方法。 

背景技术

生物柴油是由动植物油脂与短链醇甲醇或乙醇，在催化剂的作用下发生转酯化反应生成的长链脂肪酸甲酯或者乙酯，是一类环保、可再生的，可替代石化柴油的清洁能源。制备生物柴油的催化剂可分为酸碱催化剂和脂肪酶催化剂。酸碱催化存在环境污染、腐蚀生产设备等缺陷。对于酸价较高的废弃油脂（如地沟油），碱催化还会形成皂化反应，妨碍反应的进一步进行。脂肪酶催化可克服上述酸碱催化的缺陷而受到学术界和工业界的重视。目前脂肪酶催化生物柴油应用得较多的是固定化脂肪酶和全细胞形式的脂肪酶催化剂。与固定化脂肪酶相比较，全细胞催化剂避免了酶的分离纯化和固定化操作，进一步降低了催化剂制备成本。 

目前，已有酶催化技术，有以下几类全细胞形式的脂肪酶催化剂应用于生物柴油催化：野生型丝状真菌、重组型丝状真菌、重组大肠杆菌、重组酿酒酵母、基于表面展示的重组型酿酒酵母和毕赤酵母。野生型和重组型丝状真菌全细胞脂肪酶在发酵培养时，需要加入生物兼容性树脂等固定化材料，制备固定化全细胞，无疑增加了全细胞催化剂的成本。如中国专利（CN1944629）公开了酵母菌体与固定化材料硅藻土、海藻酸钠、二氯化钙的固定化全细胞制备方法；中国专利（200610089767.1）公开了游离型和戊二醛聚氨酯交联的固定化丝状真菌米根霉Rhizopus oryzaeIFO4697细胞催化脂肪酸及含酸油脂生产生物柴油的方法。重组大肠杆菌，重组酿酒酵母全细胞脂肪酶由于细胞高密度发酵能力不及毕赤酵母，在规模化制备全细胞催化剂上存在不足。酿酒酵母还存在过糖基化现象，影响功能性脂肪酶的表达量。而基于表面展示的重组酵母全细胞脂肪酶由于锚定蛋白和目标脂肪酶是以融合蛋白的形式表达，会造成活性脂肪酶表达量不高，而且寻求锚定蛋白、宿主与目标脂肪酶之间的兼容性耗时费力。 

相比较而言，毕赤酵母高密度发酵能力优于丝状真菌、大肠杆菌、酿酒酵母。与酿酒酵母比较，不存在过糖基化现象。而且与胞外分泌表达一样，毕赤酵母胞内表达可以获得比表面展示表达更高的活性表达量，且遗传操作不及表面展示复杂，具有工业应用的全细胞催化剂应满足可高密度发酵规模化制备，全细胞中含有足够量的活性脂肪酶，同时无需固定化步骤，对于重组全细胞还要求遗传操作简单，成本低廉。经检索，胞内重组表达的重组型毕赤酵母全细胞催化剂及其生物柴油催化应用尚未见报导。 

因此，目前需要研究开发一种能够高密度发酵、脂肪酶活性表达量高、遗传操作简易的重组全细胞脂肪酶制备及其催化生物柴油技术。 

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种毕赤酵母全细胞脂肪酶催化制备生物柴油的方法。 

本发明的技术方案是： 

一种毕赤酵母全细胞脂肪酶催化制备生物柴油的方法，以脂肪酶基因、重组载体和酵母宿主为出发材料，利用酵母重组表达和高密度发酵，基于高效胞内表达脂肪酶制备重组毕赤酵母全细胞，同时结合通透性处理，将通透型酵母全细胞应用于生物柴油催化，制备高得率的生物柴油，其工艺步骤为：

(1)重组及转化：通过构建目的脂肪酶基因的重组质粒，重组质粒的转化，及含有高拷贝目的基因转化子的筛选，得到高效的胞内表达重组酵母工程菌；

(2)诱导：通过重组酵母工程菌菌体积累阶段和脂肪酶诱导表达阶段培养方式，高密度生产重组酵母细胞及高效表达胞内脂肪酶，得到湿全细胞；

(3)通透处理：采用短链醇和/或冷冻干燥对湿全细胞进行通透性处理，得到通透性全细胞；

(4)催化合成：以油脂和短链醇为底物，以通透性酵母全细胞为催化剂，在无溶剂体系或溶剂体系中反应合成生物柴油。

以上步骤(1)中所述的重组质粒为pPICZA与目标脂肪酶基因连接构建重组质粒，然后转化毕赤酵母感受态细胞，得到高拷贝目标基因的转化子；所述的高拷贝基因的转化子为在浓度为500-2000 μg/ml 博莱霉素（Zeocin）抗性YPD平板上能正常生长的转化子；所述毕赤酵母为Pichia pastoris X33或Pichia pastoris GS115或Pichia pastoris KM71。