[发明专利]毕赤酵母全细胞脂肪酶催化制备生物柴油的方法

权利要求书

1.一种毕赤酵母全细胞脂肪酶催化制备生物柴油的方法，其特征在于：以脂肪酶基因、重组载体和酵母宿主为出发材料，利用酵母重组表达和高密度发酵，基于高效胞内表达脂肪酶制备重组毕赤酵母全细胞，同时结合通透性处理，将通透型酵母全细胞应用于生物柴油催化，制备高得率的生物柴油，其工艺步骤为：

(1)重组及转化：通过构建目的脂肪酶基因的重组质粒，重组质粒的转化，及含有高拷贝目的基因转化子的筛选，得到高效的胞内表达重组酵母工程菌；

(2)诱导：通过重组酵母工程菌菌体积累阶段和脂肪酶诱导表达阶段培养方式，高密度生产重组酵母细胞及高效表达胞内脂肪酶，得到湿全细胞；

(3)通透处理：采用短链醇和/或冷冻干燥对湿全细胞进行通透性处理，得到通透性全细胞；

(4)催化合成：以油脂和短链醇为底物，以通透性酵母全细胞为催化剂，在无溶剂体系或溶剂体系中反应合成生物柴油。

2.根据权利要求1所述的一种毕赤酵母全细胞脂肪酶催化制备生物柴油的方法，其特征在于：以上步骤(1)中所述的重组质粒为pPICZA与目标脂肪酶基因连接构建重组质粒，然后转化毕赤酵母感受态细胞，得到高拷贝目标基因的转化子；所述的高拷贝基因的转化子为在浓度为500-2000μg/ml 博莱霉素（Zeocin）抗性YPD平板上能正常生长的转化子；所述毕赤酵母为Pichia pastoris X33或Pichia pastoris GS115或Pichia pastoris KM71。

3.根据权利要求1所述的一种毕赤酵母全细胞脂肪酶催化制备生物柴油的方法，其特征在于：以上步骤(2)中所述的菌体积累阶段为重组酵母工程菌在以甘油为碳源的BMGY培养基中，待菌体密度达到OD₆₀₀₌2-6时，进入脂肪酶表达阶段；所述的脂肪酶诱导表达阶段是指以甲醇为唯一碳源的BMMY培养基，每隔24h添加1%（v/v）甲醇至培养液中，保持脂肪酶的诱导表达和菌体的进一步生长；

所述的高密度生产是指由菌体积累阶段过渡到脂肪酶诱导表达阶段，需要更换新鲜培养基；需将菌体积累阶段获得的菌体室温无菌离心收获，然后将这些菌体无菌转接到脂肪酶诱导表达的新鲜培养基中，并开始每隔24h添加甲醇开始诱导并进一步大量积累菌体；

所述的高效表达是指受甲醇诱导的强启动子在持续的甲醇诱导条件下驱动脂肪酶大量表达；所述的胞内为没有信号肽指引的蛋白质转运，表达生产的脂肪酶保留在胞内，而没有分泌到胞外的培养液中。

4.根据权利要求1所述的一种毕赤酵母全细胞脂肪酶催化制备生物柴油的方法，其特征在于：以上步骤(2)中所述的诱导的培养条件为：摇瓶装液量10-30%，摇床转速250-300rpm，培养温度为28-30°C，菌体积累阶段培养时间12-18h，诱导表达阶段培养时间24-168h；

所述的湿全细胞的获取条件为将诱导后的培养物4°C，4000g离心5min，再用0.85%NaCl溶液重悬再离心两次，得到湿全细胞。

5.根据权利要求1所述的一种毕赤酵母全细胞脂肪酶催化制备生物柴油的方法，其特征在于：以上步骤(3)所述的通透处理为将湿全细胞在短链醇溶液中处理10-360min，然后离心收集全细胞；所述的短链醇为10-40%（v/v）的甲醇、乙醇、异丙醇；所述的冷冻干燥为湿全细胞在-80°C下冷冻12-24h，然后在-50°C下冷冻干燥24-72h；所述的通透性全细胞为采用上述短链醇和/或冷冻干燥处理过的全细胞。