[发明专利]一种快速高效的引入定点突变的方法

权利要求书

1.一种快速高效引入定点突变的方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）根据突变碱基的位置，设计包含酶切位点的正向、反向引物，PCR扩增含有定点突变的片段；将PCR产物与YIplac211质粒同时酶切，用T4聚合酶连接；将连接体系导入DH5α感受态细胞，获得重组质粒，酶切验证，测序鉴定；

（2）获得工业菌株的尿嘧啶营养缺陷型：设计正向、反向引物，从酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）W303-1a扩增突变基因ura3,用醋酸锂转化法导入出发菌株，获得其尿嘧啶营养缺陷菌株；

（3）在突变片段上选择一个合适单一酶切位点将（1）中重组质粒线性化；运用醋酸锂转化法，将其导入步骤（2）获得的营养缺陷型菌株，通过正向重复序列的第一次重组，将质粒序列整合到了基因组上，在不含尿嘧啶的完全合成培养基上筛选阳性转化子同时菌落PCR加以验证；

（4）将（3）得到的阳性转化子，涂布在含5-氟乳清酸的完全合成培养基上，基因组发生第二次重组，将质粒弹出，可得到野生型菌株和定点突变的菌株；

（5）通过测序得以最终确定携带定点突变的菌株；

（6）用（2）中引物扩增正常的URA3基因，将其导入（5）获得的菌株，回复其营养缺陷。

2.根据权利要求1所述的快速高效引入定点突变的方法，其特征在于，步骤（3）所述不含尿嘧啶的完全合成培养基组成如下：YNB6.7g/L，葡萄糖20g/L，Ura Minus Media Dropout powder0.83g/L，腺嘌呤50mg/L，组氨酸100mg/L，亮氨酸100mg/L，色氨酸100mg/L，液体培养基pH5.6,固体培养基添加2%的琼脂粉，pH6.5。

3.根据权利要求1所述的快速高效引入定点突变的方法，其特征在于，步骤（4）所述含5-氟乳清酸的完全培养基制备方法如下：YNB1.4g，葡萄糖4g，Ura Minus Media Dropout powder0.17g，5-FOA0.2g，尿嘧啶20mg，腺嘌呤10mg，亮氨酸40mg，组氨酸30mg，色氨酸20mg，蒸馏水定容到100mL，45℃下连续搅拌至各组分全部溶解，过滤除菌，将另外的100mL灭过菌的3.5%（m/v）的琼脂粉溶液与其混合，缓慢摇匀，倒入无菌培养皿，冷却成型。