[发明专利]荧光染料修饰的核苷酸及类似物的固相合成方法

说明书

技术领域

本发明涉及荧光染料修饰的核苷酸及类似物的固相合成方法。

背景技术

荧光染料修饰的核苷酸及类似物广泛应用于生物分析，DNA序列分析和临床诊断等领域。荧光染料修饰的核苷酸及类似物一般在水中溶解度高，极性大。液相合成的方法一般操作繁琐，分离比较困难，分离纯化需要结合反相色谱和离子色谱去除反应体系中残余的游离的荧光染料和核苷酸，难以大量生产。

美国化学家Merrifield（Merrifield, R. B. J. Am. Chem. Soc. 1963, 85, 2149.）在1963 年首先用树脂负载法合成了四肽化合物以来, 固相有机合成已经从最初的肽合成扩展到各类有机小分子，复杂天然产物的合成和DNA合成等领域。固相合成的特点是简化了多步骤的合成，可避免因手工操作和物料重复转移而产生的损失；固相载体共价相联的肽链处于适宜的物理状态，可通过快速的抽滤、洗涤未完成中间的纯化。使用过量反应物，使目标反应完全，使最终产物得到较高的产率。

本发明的目的在于提供荧光染料修饰的核苷酸及类似物的固相合成方法，解决荧光染料修饰的核苷酸及类似物液相合成分离困难导致难以大量生产的技术问题。

发明内容

本发明提供了一种制备式（1）荧光染料修饰的核苷酸及类似物的固相合成方法， 

  （I）

其中取代基具有以下的含义：

M是H, Na或K

R1为H或OH

R2为H或OH

R3为C1-C8直链烷基(CH₂)n

Base为具有下列结构的碱基或碱基类似物取代基：

Dye为具有下列结构的荧光染料取代基团：

其中取代基具有以下的含义：

R4为OH, NH₂， N（Me）₂或N（Et）₂, N（Pr）₂

R5为O,或NH₂⁺, N（Me）₂⁺或N（Et）₂⁺, N（Pr）₂⁺

R6为H, F, Cl，Br或I

R7和R8为H或CH₂NH₂，或者具有以下结构的取代基：

R9为H，CH₃或CH₂CH₃

其特征是包括以下步骤：

a.       将式（II）化合物

            （II）

用DMF溶解,再加入氢氧化钠和树脂，搅拌均匀，振荡反应；再分别用N,N’-二甲基甲酰胺,二氯甲烷,醋酸水溶液和甲醇洗涤后，得到式（III）化合物

（III）；

b.      将式（IV）化合物

 (IV)

其中FMOC为芴甲氧羰基

与式（III）化合物碘化铜以及无水DMF混合，在氦气保护下, 注入无水三乙胺，反应10-20min 后, 在惰性气体的保护下，迅速投入四(三苯基膦)钯, 反应结束后再分别用N,N’-二甲基甲酰胺,二氯甲烷,醋酸水溶液和甲醇洗涤后，再加入六氢吡啶的N,N’-二甲基甲酰胺溶液，去掉芴甲氧羰基，得到式（V）化合物

    （V）；

c. 将式（VI）化合物

（VI）

R10和R11为H或芴甲氧羰基氨基甲基，或者具有以下结构的取代基：

与式（V）混合与中，加入羟基苯并三唑，N,N'-二异丙基碳二亚胺和4-二甲氨基吡啶，经酰胺化反应后，再分别用N,N’-二甲基甲酰胺,二氯甲烷,醋酸水溶液和甲醇洗涤，获得式(VII)化合物；R10和R11为芴甲氧羰基氨基甲基时，树脂洗涤后加入六氢吡啶的N,N’-二甲基甲酰胺溶液，去掉芴甲氧羰基后获得式(VII)化合物

（VII）；

d. 在所得的式(VII)化合物中加入盐酸，振荡后过滤，取滤液洗涤后冻干得到式(I)化合物。